全蝎水提物对巨噬细胞活化作用研究①

刘　芬　侯　睿　费巧玲　高　源　蔡润兰　陶燕蓉　王峥涛　齐　云

(中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所药理毒理中心,北京100193)



全蝎水提物对巨噬细胞活化作用研究①

刘芬侯睿费巧玲高源蔡润兰陶燕蓉②王峥涛③齐云

(中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所药理毒理中心,北京100193)

[摘要]目的：观察全蝎水提物(Buthus martensii water extract，BMWE)在体外对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的活化作用。方法：MTT法测定细胞活性；采用FITC标记的酵母测定吞噬活性；利用Griess试剂和ELISA方法测定细胞上清NO、TNF-α和IL-6释放量。结果：BMWE在不影响细胞活力的剂量范围内可增强正常及免疫抑制的RAW264.7细胞吞噬荧光酵母能力(P<0.01)，增加RAW264.7细胞NO释放量(P<0.01)，促进RAW264.7细胞TNF-α和IL-6产生(P<0.01)，均具有良好的量效关系。结论：BMWE可明显提高巨噬细胞吞噬功能与分泌能力，活化巨噬细胞，此作用与全蝎传统用于治疗疮疡、瘰疬，现代用于肿瘤的临床应用相关。

[关键词]全蝎水提物；巨噬细胞；吞噬活性；一氧化氮；白介素-6；肿瘤坏死因子-α

全蝎为节肢动物门蛛形纲钳蝎科东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的干燥全体，性平，味辛，具有息风止痉、攻毒散结、通络止痛的功效，常用于惊厥、破伤风痉挛、疮疡肿毒、瘰疬结核、风湿痹痛等症。现代研究发现全蝎具有镇痛、镇静、抗凝、抗血栓、抗哮喘、抗肿瘤、抗癌等作用[1,2]。

巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内不同的微环境影响下，受到不同异物或细胞因子的刺激，从而被活化[3]。在炎症反应初期阶段，巨噬细胞活化主要表现为吞噬功能增强，一些调节免疫应答的细胞因子(NO、TNF-α等)合成及分泌适量增加[4,5]，以此对入侵的病原微生物或肿瘤细胞等发挥吞噬或细胞毒作用，积极调节机体免疫在一个可控的范围内发展。传统中医将全蝎用治疮疡肿毒、瘰疬结核，现代常用于肿瘤。有报道巴西钳蝎的毒液和毒素(Ts1、Ts6)能够增加巨噬细胞炎症介质释放，促巨噬细胞的活化[6]，东亚钳蝎蝎毒多肽能够通过增加Beclin1、MAP1LC3A的蛋白表达，促进自噬的发生，从而对S180肉瘤细胞产生自噬性作用[7]。当然，巴西钳蝎与东亚钳蝎所属物种有别，虫体也不能与毒液或毒素等同(尽管虫体中残存蝎毒)。但这些信息使我们对全蝎是否也会影响巨噬细胞活化很感兴趣。本文即是在此背景下进行了以下的研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器EVOS FL AUTO全自动荧光倒置显微镜、Multiskan Ascent酶标仪、Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL发光分析仪，美国Thermo Electron公司产品。BT125D电子天平，德国Sartorius产品。Napco5410型二氧化碳孵箱，美国NAPCO产品。XDS-1B倒置显微镜，重庆光电仪器公司。

1.1.2主要试剂地塞米松(Dex)、异硫氰酸荧光素(FITC)、脂多糖(LPS)均为Sigma公司产品。胎牛血清、DMEM培养基均为Gibco公司产品。IL-6和TNF-α检测试剂盒为BioLegend产品。N-1-萘乙二胺二盐酸盐、磺胺，源自北京化学试剂公司。干酵母源自安琪酵母有限公司。其余均为国产分析纯。

1.1.3实验药物全蝎水提物(BMWE)由上海中医药大学中药研究所提供，经鉴定为东亚钳蝎Buthus martensii karsch的干燥体。采用常规方法制备水煎剂，第一次10倍量水(w/w)，第二次8倍量水，沸腾开始计时，1 h/次，合并滤液，冷冻干燥。冷冻干燥后计算得率为28.7%。

1.1.4实验用细胞株小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞源于美国ATCC公司。

1.2方法

1.2.1FITC与酵母偶联按文献[8]法取适量干酵母高压灭活，磷酸盐缓冲液(PBS)溶解并洗涤三次，1 000 r/min离心10 min得到酵母沉淀物。以碳酸氢盐缓冲液(CBS)重悬酵母沉淀物，显微镜下计数并调整酵母浓度为4×108个/ml，加入等体积的FITC溶液(100 μg/ml)，室温下搅拌30 min。等量PBS洗涤酵母，离心，以含4%BSA的CBS重悬酵母,调节细胞浓度为4×108个/ml，室温下搅拌15 min。先后以适量PBS、含4%BSA的PBS洗涤4次以除去游离FITC，1 000 r/min离心10 min得到偶联酵母沉淀物。最后用适量PBS重悬酵母，冻干保存。

1.2.2BMWE对RAW264.7细胞活力的影响[9]细胞按1×105个/孔接种于96孔细胞培养板中，加入不同浓度的BMWE(正常对照组加入等体积的培养基代替BMWE，本底孔以等体积培养基代体细胞悬液)，孵育20 h，每孔加入20 μl MTT，继续孵育4 h后，倾去上清，加入100 μl DMSO，振荡10 min，于540nm处测定OD值。按以下公式计算存活率:存活率%=(OD药物-OD本底)/(OD正常-OD本底)×100%。

1.2.3荧光显微镜观察BMWE对正常及免疫抑制RAW264.7细胞吞噬荧光酵母的影响[10]细胞按3×105个/孔接种于24孔细胞培养板中，400 μl/孔。贴壁后加无血清DMEM培养基400 μl/孔(免疫抑制组DMEM含10 μmol/L的Dex)，孵育2 h后，正常及Dex预处理(免疫抑制)细胞均加入100 μl不同浓度BMWE，阳性对照组加入100 μl终浓度为0.01 μg/ml的LPS，置孵箱中养24 h，吸弃上清，每孔加入500 μl带荧光的酵母悬液(酵母∶巨噬细胞=40∶1)与细胞共培养2 h。每孔加入500 μl台盼蓝溶液(1.25 mg/ml，用D-hank′s液配制)，1 min以淬灭胞外荧光，马上于全自动荧光显微镜下观察细胞吞噬荧光酵母情况(放大倍数为800倍)。

1.2.4荧光酶标仪测定BMWE对正常及免疫抑制RAW264.7细胞吞噬荧光酵母的影响[10]细胞按1×105个/孔接种于96孔黑色细胞培养板中，100 μl/孔。贴壁后加无血清DMEM培养基100 μl/孔(免疫抑制组DMEM含10 μmol/L的Dex)，孵育2 h后，正常及Dex预处理(免疫抑制)细胞均加入100 μl不同浓度BMWE，阳性对照组加入100 μl终浓度为0.01 μg/ml的LPS，置孵箱中养24 h，弃上清，每孔加入100 μl带荧光的酵母悬液(酵母∶巨噬细胞=40∶1)与细胞共培养 2 h。每孔加入200 μl台盼蓝溶液(1.25 mg/ml，用D-hank′s液配制)，1 min以淬灭胞外荧光。D-hank′s液洗细胞2次，每孔加入200 μl D-hank′s液，在荧光酶标仪λex485，λem538 nm处测定荧光强度。

1.2.5BMWE对RAW264.7细胞NO、TNF-α和IL-6释放的影响[11]细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后加入不同浓度的BMWE(正常和阳性对照加入等体积的培养基或LPS)，孵育24 h，Griess法测定上清中NO2-的含量，用以反映NO分泌水平[12]；参照ELISA试剂盒说明书测定上清液中TNF-α和IL-6的含量。

2结果

2.1BMWE对RAW264.7细胞活力的影响当BMWE使用剂量为400 μg/ml时，能显著抑制细胞增殖，抑制率为35%(P<0.01)；而当剂量≤200 μg/ml时，BMWE对细胞活力无显著影响(见图1)，故本研究的使用剂量均在200 μg/ml以下。

2.2BMWE对正常及免疫抑制巨噬细胞吞噬功能的影响

2.2.1BMWE对正常RAW264.7细胞吞噬功能的影响如图2、3所示，以测得正常细胞的荧光值为相对值1，6.25 μg/ml BMWE作用下的细胞相对荧光值约为1.7，且具有统计学差异。因此，6.25 μg/ml 的BMWE可明显提高RAW264.7细胞对酵母的吞噬能力，且随剂量增高，作用增强，在6.25～50 μg/ml 剂量范围内显示良好的线性关系。

2.2.2BMWE对免疫抑制RAW264.7细胞吞噬功能的影响免疫抑制处理后，RAW264.7细胞吞噬酵母的能力明显降低(见图4)，相对荧光值降为约0.4，与正常细胞比具有显著性差异(P<0.01)。浓度为6.25 μg/ml 时相对荧光值接近1，且随剂量增高，相对荧光值增加，在6.25～50 μg/ml 剂量范围内显示良好的线性关系(见图5)。由此可见，BMWE可明显提高免疫抑制RAW264.7细胞对酵母的吞噬能力。

图1　BMWE对RAW264.7细胞活力的影响Fig.1　Effect of BMWE on RAW264.7 cells viabilityNote: *.P<0.01,compared with normal control group.

图2　荧光酶标仪测定BMWE对正常RAW264.7 细胞吞噬荧光酵母的影响Fig.2　Effect of phagocytic activity of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.05,compared with LPS group.

图3　荧光显微镜观察BMWE对正常RAW264.7 细胞吞噬荧光酵母的影响Fig.3　Effect of phagocytic activity of RAW264.7 cells induced by BMWENote: A.Normal control group；B.12.5 μg/ml BWME group；C.100 μg/ml BMWE group；D.LPS group.

图4　荧光酶标仪测定BMWE对免疫抑制RAW264.7 细胞吞噬荧光酵母的影响Fig.4　Effect of phagocytic activity of immune inhibition RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with Dex group;#.P<0.05,compared with LPS+Dex group.

图5　荧光显微镜观察BMWE对免疫抑制RAW264.7 细胞吞噬荧光酵母的影响Fig.5　Effect of phagocytic activity of immune inhibition RAW264.7 cells induced by BMWENote: A.DEX group；B.DEX+12.5 μg/ml BMWE group；C.DEX+100 μg/ml BWME group；D.DEX+LPS group.

图6　BMWE对RAW264.7 细胞释放NO的影响Fig.6　Effect of NO production of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.01,compared with LPS group.

图7　BMWE对RAW264.7 细胞释放TNF-α的影响Fig.7　Effect of TNF-α production of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.01,compared with LPS group.

2.3BMWE对RAW264.7细胞NO、IL-6和TNF-α释放的影响从图6～8中可以看到，BMWE在终浓度25～100 μg/ml均可明显促进RAW264.7细胞对NO、IL-6和TNF-α的分泌，且呈现出良好的量效关系。同时，我们也注意到，BMWE对三种因子的促分泌作用上存在不同的敏感性，这种差异性可能正是其临床应用于不同适应症时疗效优劣不一的原因之一。

图8　BMWE对RAW264.7 细胞释放IL-6的影响Fig.8　Effect of IL-6 production of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.01,compared with LPS group.

3讨论

目前，国外学者对蝎的研究主要集中于蝎毒液和蝎毒的药理作用研究上，巴西钳蝎的毒液能够促进巨噬细胞NO、IL-6、TNF-α、IFN-γ、H2O2的产生，毒素(Ts1、Ts6)能够增加巨噬细胞上清NO、IL-6、TNF-α含量，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物和肿瘤细胞，调节机体免疫功能[6,13，14]。全蝎在免疫调节方面是否与其报道的毒液有相似之处，这是一个值得研究的问题。中医临床传统将全蝎用于治疗疮疡、瘰疬而现代全蝎在抗肿瘤上的运用[2,15]，都提示虫体可能有类似其所含毒液的促巨噬细胞活化的作用。通过我们的研究发现，全蝎水提物(BMWE)能增强正常或免疫抑制的巨噬细胞吞噬能力,促进细胞分泌细胞因子，活化巨噬细胞。活化的巨噬细胞不仅能吞噬侵入机体的病原微生物还能吞噬机体本身凋亡细胞及肿瘤细胞[3]。因此，这对于炎症早期病原微生物的清除和发病初期肿瘤细胞转归具有有益作用[16]。在促分泌上，实验显示全蝎水提物能促进巨噬细胞释放TNF-α、NO及IL-6炎症介质。我们知道，TNF-α具有免疫调节作用，能促进树突状细胞成熟及T细胞增殖和激活，上调IL-12、IL-1、趋化因子受体等的表达[17]，同时TNF-α是迄今为止抗癌活性最强的因子，不仅能增强宿主免疫力还能诱导肿瘤细胞凋亡。NO的作用之一就是增强巨噬细胞对抗病毒、真菌、细菌、肿瘤细胞等作用。IL-6不仅能促进细胞增殖、分化、免疫防御机制增强等，还能通过干预细胞的黏附性和活动力、肿瘤特异性抗原的表达及肿瘤细胞的增殖从而影响肿瘤的生长。对巨噬细胞吞噬能力的判断可通过直接测定吞噬物或采用间接的方法，由于巨噬细胞吞噬微生物后会影响微生物细胞活力[18]或自身产生活性氧(H2O2、O2-、OH-)[19]，因此可以通过测定细胞的活力或胞内活性氧等来间接反映巨噬细胞的吞噬能力。而常用的直接法如吞噬红细胞[20]或中性红[21]等可直接通过镜下计数红细胞或比色法判断其吞噬量的多少。近年来，有人采用荧光微球[22]、荧光素标记的大肠杆菌[23,24]等为吞噬物，以流式细胞仪对巨噬细胞内标记物进行检测。然而吞噬异种红细胞或中性红的方法与实际病理情况差异较大，且检测灵敏度不高；流式仪测定又受限制于研究者单位的硬件条件。在本实验中，我们以自制FITC标记酵母与巨噬细胞共同孵育，再以荧光光度计检测巨噬细胞对酵母的吞噬情况，该法具有简便、灵敏、准确且对仪器条件要求不高的优势[25]。通过此法，我们发现BMWE具有较好的促巨噬细胞吞噬能力的作用。事实上，有学者以全蝎连续灌胃小鼠7 d发现其腹腔巨噬细胞在吞噬鸡红细胞能力上显著提高[26]，这一体内实验结果与我们的体外研究结果是一致的。

综上，我们认为全蝎的这种增强正常及免疫抑制巨噬细胞吞噬能力和促正常巨噬细胞NO、TNF-α、IL-6分泌的作用有助于巨噬细胞吞噬微生物或肿瘤凋亡细胞，也有助于机体对抗异物入侵和抗肿瘤。这些作用可能是传统中医用于治疗疮疡、瘰疬，现代用治肿瘤的药理学基础。

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[收稿2015-09-01修回2015-11-27]

(编辑张晓舟)

Studies on macrophage activations of BMWE in vitro

LIUFen,HOURui,FEIQiao-Ling,GAOYuan,CAIRun-Lan,TAOYan-Rong,WANGZheng-Tao,QIYun.

InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China

[Abstract]Objective:To investigate the activation effect of Buthus martensii water extract(BMWE)in RAW 264.7 cells.Methods: The MTT assay and FITC-conjugated yeast were used to evaluate the effects of BMWE on the viability and phagocytosis of RAW264.7 cells,respectively.NO production in supernatant was measured by Griess reagent.IL-6 and TNF-α production of the cells induced by BMWE were measured by ELISA.Results: Cell viability analysis showed that BMWE did not affect the cell viability up to a concentration of 200 μg/ml.Pretreatment with BMWE potently enhanced phagocytic function(P<0.01)in the presence or absence of dexamethasone in RAW 264.7 cells.BMWE also significantly increased NO,TNF-α and IL-6 production(P<0.01)in a dose-dependent manner.Conclusion: BMWE can activate the macrophages showing that the phagocytosis and secretion function were markedly enhanced.

[Key words]BMWE;Macrophages;Phagocytosis;NO;IL-6;TNF-α

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.013

作者简介：刘芬(1987年-)，女，在读硕士，主要从事抗炎与免疫药理学研究。通讯作者及指导教师：齐云(1964年-)，男，博士，研究员，主要从事抗炎与免疫药理学研究，E-mail: yqi@implad.ac.cn。

中图分类号R392.12

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0660-05

·中医中药与免疫·

①本文受国家科技重大专项(2014ZX09201022-006、2012ZX09301-002-001)及北京自然科学基金项目(7142112)资助。

②北京中医药大学东直门医院，北京100029。

③上海中医药大学中药研究所，上海201203。