山楂提取物对急性损伤线虫的保护作用

赵江陈纯王轶菲，2王红，2黄杰，2王浩

（1. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2. 天津科 技大学生物工程学院，天津 300457）

山楂提取物对急性损伤线虫的保护作用

赵江1陈纯1王轶菲1，2王红1，2黄杰1，2王浩1

（1. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2. 天津科 技大学生物工程学院，天津 300457）

以秀丽隐杆线虫（Canorhabditis elegans）为模式生物研究山楂提取物（Haworth fruit extract，HFE）对其急性氧化损伤的保护作用及其可能的作用机制。饲喂线虫于含有不同浓度（0、25、50和100 μg/mL）HFE的NGM（Nematode growth medium）培养基中，研究HFE对线虫急性应激耐受能力的影响。结果显示，饲喂HFE后，秀丽线虫表现出比正常组更高的寿命，并且在胡桃醌氧化应激、热应激及紫外辐射应激实验中寿命均明显延长，荧光显微镜观察发现HFE组线虫的脂褐素自发荧光明显减弱，并且与HFE浓度呈剂量依赖效应。 HFE能够显著延长秀丽隐杆线虫的寿命，同时对多种氧化损伤具有较好的保护作用，改善机体的抗氧化能力，有效延缓衰老。

秀丽隐杆线虫；山楂提取物；急性损伤；延缓衰老

在正常情况下，生物体内处于氧化与抗氧化的动态平衡状态，保护机体免受损伤。生物体内最初的自由基是由机体正常的代谢活动产生［1］，但是当受到外界有害刺激，例如，胡桃醌在线虫体内分解为超氧化物自由基，紫外线辐射会破坏机体内的代谢平衡，导致ROS的积累，从而机体内活性氧自由基的数量会显著增多，造成脂质过氧化反应的发生，加速机体组织功能的损伤［2］。如果不及时清除体内过量的自由基，就会引起机体内包括蛋白、核酸及其他大分子物质的氧化损伤，对细胞活性和功能造成极大的伤害［3］。

秀丽隐杆线虫生命周期短暂，是研究药物药理学和药物影响基因表达的理想模式生物［4］。有研究表明线虫长寿突变体能够增强抵抗氧化应激、紫外辐射损伤、热应激等破坏胞内动态平衡体系的刺激的能力［5］，而所有能够提高线虫抵抗外界刺激能力的干预措施均能够延长线虫的寿命［6］。

山楂作为一种药食同源的水果，已经被卫生部认定为功能性食品的原料，并作为中草药收录于药典中［7］。其富含原花青素、黄酮等多种活性成分，可以有效清除体内自由基，减少氧化损伤，具有显著的抗氧化活性。本研究以秀丽隐杆线虫为实验模式生物，对山楂提取物的体内抗氧化活性进行了研究，观察正常寿命变化，氧化应激能力的变化，以此评价HFE的抗氧化能力及调控衰老的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型秀丽隐杆线虫、OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌（E. coli）均由天津科技大学食品添加剂与营养调控研究室提供。山楂提取物购自天津尖峰有限公司。HWS-850恒温恒湿生化培养箱：宁波海曙赛福实验仪器厂；台式冷冻离心机：美国Thermo公司；CKX41荧光显微镜：奥林巴斯有限责任公司；UVmini-1240紫外分光光度计：日本岛津仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 寿命实验 用M9缓冲液反复冲洗NGM培养基表面的线虫，离心，弃上清，加入M9及线虫裂解液，离心，20℃静置过夜，虫卵孵化成L1期线虫，接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，20℃培养48-54 h，即得到L4期线虫。收集同期化线虫，随机分为4组，挑取线虫 至不同浓度山楂提取物的NGM培养基（0、25、50和100 μg/mL），每组5板，每板30条。每4 d更换一次相应的新鲜培养基，每2 d定点计数1次，同时观察线虫的生存状况，直至线虫全部死亡为止，绘制线虫寿命曲线。

1.2.2 SOD活性的测定 按照寿命实验中的饲养方法培养5-6 d。M9缓冲液冲洗NGM表面的线虫，离心，弃上清。加入生理盐水冰上匀浆，离心，取上清。根据SOD测定试剂盒说明进行测定。

1.2.3 急性实验

1.2.3.1 胡桃琨急性实验 按照寿命实验中的饲养方法培养5-6 d。挑取线虫转移到胡桃琨终浓度为500 μmol/L的NGM培养基中。每小时计数1次，挑出死亡线虫并计数。直至线虫全部死亡为止，绘制线虫寿命曲线。收集存活率为20%时期的线虫，NaN3麻醉线虫，倒置荧光显微镜下，激发340-380 nm，发射430 nm，观察线虫体内脂褐素水平，固定曝光时间和强度，拍摄荧光图片，检测线虫体内脂褐素水平。倒置荧光显微镜观察线虫体内脂褐素水平。

1.2.3.2 高温热急性实验 按照寿命实验中的饲养方法培养5-6 d。挑取线虫转移到NGM培养基中，30℃，预热培养1 h，然后转移至35℃继续培养。每小时计数1次，挑出死亡线虫并计数直至线虫全部死亡为止，绘制线虫寿命曲线。收集存活率为20%时期的线虫，倒置荧光显微镜观察线虫体内脂褐素水平。

1.2.3.3 紫外辐射急性实验 按照寿命实验中的饲养方法培养5-6 d，挑取线 虫转移到NGM培养基中。将秀丽线虫置于辐射强度为75 uw/cm2紫外线下，暗视野照射13 min。每30 min计数1次，挑出死亡线虫并计数。直至线虫全部死亡为止，绘制线虫寿命曲线。收集存活率为20%时期的线虫，倒置荧光显微镜观察线虫体内脂褐素水平。

1.3 数据的分析与处理

使用SPSS statistics17.0，Excel2003等软件对实验数据进行统计学分析处理，采用（）的方法表示结果。P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异，以上结果均具有统计学意义。

2 结果

2.1 山楂提取物的活性成分

由液相谱图结果（图1）分析可得，山楂提取物的主要活性成分及其所占比重分别为原花青素B219.86%，表儿茶素15.27%，绿原酸3.10%，金丝桃苷2.91%，异槲皮素1.34%。

2.2 山楂提取物对线虫寿命 的影响

HFE组线虫的平均寿命和最高寿命均高于对照组（表1，图1），且线虫寿命随着HFE浓度的升高呈明显的剂量效应关系，其中100 μg/mL HFE的平均寿命和最高寿命分别较对照组延长了23.24%（P<0.05），25.49%（P<0.01），表明HFE能够有效的延缓线虫衰老，延长寿命。

图1 高效液相色谱法测定山楂活性成分

表1 山楂提取物对线虫寿命的影响

图2 线虫寿命曲线

2.3 山楂提取物对线虫体内SOD活力的影响

SOD作为线虫体内最主要的抗氧化酶，主要清除机体内过量的超氧化物自由基。数据（图3）表明总SOD及Cu，Zn-SOD活力与HFE浓度呈剂量依赖效应。其中50和100 μg/mL HFE组线虫总SOD活力分别较对照组提高了8.6%（P<0.05）、16.4%（P<0.05），100 μg/mL HFE组线虫Cu，Zn-SOD活力提高了24.4%（P<0.05）。

图3 线虫体内SOD活力

2.4 急性实验结果

2.4.1 山楂提取物对胡桃琨氧化损伤线虫的保护作用 数据（图4）显示HFE能够有效延长胡桃醌氧化损伤线虫的平均存活时间，减少线虫体内脂褐素堆积水平，其中50和100 μg/mL剂量组线虫体内脂褐素荧光水平分别较对照组下降了36.73%（P<0.01）及53.65%（P<0.01）。

2.4.2 山楂提取物对热急性损伤线虫的保护作用

数据（图5）显示，0、25、50和100 μg/mL HFE组秀丽线虫在35℃高温环境中的平均存活时间分别为10.22、11.13、12.00和12.27 h，脂褐素相对荧光值分别为0.54、0.42、0.30和0.22单位，表明HFE延长线虫寿命的同时也提高线虫的热应激耐受能力。

2.4.3 山楂提取物对紫外辐射损伤线虫的保护作用 线虫存活时间曲线（图6）显示，25、50和100 μg/mL HFE剂量组线虫的平均存活寿命较对照组分别延长了6.20%、25.81%及35.44%，各剂量组线虫体内脂褐素荧光含量均显著降低（P<0.05）。

图4 胡桃醌急性实验结果（A：寿命曲线；B：脂褐素荧光图）

图5 高温急性实验结果（A：寿命曲线；B：脂褐素荧光图）

图6 紫外辐射急性实验结果（A：寿命曲线；B：脂褐素荧光图）

3 讨论

山楂富含原花青素、黄酮等多种活性成分，可以有效清除体内自由基，减少氧化损伤［8］。Liu等［9］研究发现HFE具有明显清除羟自由基与过氧化氢的能力，其抗氧化活性显著高于维生素C和维生素E。本研究显示饲喂HFE的线虫平均寿命显著延长，脂褐素水平显著降低，这与汪晓燕等［10］的正丁醇可有效减少线虫体内34.3%的ROS含量的研究结果相一致。此外，绿茶提取物儿茶素能够影响线虫daf-2胰岛素/类胰岛素信号转导途径，减少线虫氧化应激损伤［11］。

秀丽隐杆线虫是研究衰老调控机制最理想的模式生物之一。本实验以25、50和100 μg/mL剂量HFE饲喂秀丽隐杆线虫，研究显示饲喂HFE的线虫体内抗氧化酶SOD的活力显著升高，减少脂质过氧化损伤。这与Liu等［12］的研究发现侧柏中提取的500 μg/mL的正丁醇可有效减少线虫体内34.3%的ROS含量等的研究结果相一致。有研究表明胡桃醌在线虫体内的氧化还原反应会诱导产生细胞内的氧化应激分解产生超氧化物自由基［13，14］，本研究发现HFE能够显著减少氧化损伤，降低线虫体内脂褐素水平，延长线虫的存活时间。其中与对照组相比，100 μg/mL HFE降低了胡桃醌氧化损伤线虫体53.6%的脂褐素水平；研究表明，线虫寿命延长的同时其热应激的耐受能力也会有一定程度的提升［15］，热应激实验中，HFE组线虫寿命有效延长，热应激耐受能力显著提高；同时也有研究证明秀丽线虫寿命的延长伴随紫外辐射耐受能力的提高［16］，紫外辐射实验中，HFE组线虫寿命均高于对照组，且其效应与HFE剂量呈正相关，100 μg/mL HFE有效延长线虫寿命34.6%，减少线虫体内50.2%的脂褐素。这与Elena等［17］研究发现苹果提取物能够延长秀丽线虫寿命，增加线虫热应激耐受能力，其中age-1突变体线虫紫外辐射存活率提高74.4%，daf-16突变体线虫紫外辐射存活率较空白对照组降低12.8%的研究结果相一致。

4 结论

一定剂量的山楂提取物可以有效降低线虫体内脂褐素水平，在胡桃醌氧化应激、热应激及紫外辐射氧化应激实验中山楂提取物对秀丽隐杆线虫有显著的保护作用。

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（责任编辑 李楠）

The Protective Effect of Haworth Fruit Extract on Caenorhabditis elegans in Acute Damages

ZHAO Jiang1CHEN Chun1WANG Yi-fei1，2WANG Hong1，2HUANG Jie1，2WANG Hao1
（1. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

The work aims to study the protective effect of haworth fruit extract（HFE）on the acute oxidative damage and its possible protection mechanism in Caenorhabditis elegans. The C. elegans were fed with nematode growth medium（NGM）containing different dose of HFE（0，25，50 and 100 μg/mL）to study impacts of HFE on the acute stress tolerance. C. elegans with feeding in different dose of HFE had a longer lifespan than the normal group，moreover，their lifespans became significantly longer under the experiments of juglone oxidative stress，heat stress and UV radiation stress. Concurrently，the autofluorescence level of lipofuscin in HFE group of C. elegans significantly decreased and it was dose-dependent effect to the concentration of HFE. In conclusion，HFE significantly prolongs the lifespan of C. elegans and has a solid protection under a variety of oxidative stress conditions with improving the antioxidant capacity and efficient anti-aging

Caenorhabditis elegans；extract of haworth fruit；acute damage；anti-aging

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.035

2015-08-31

“十二五”国家科技计划项目（2012BAD33B05）

赵江，男，硕士研究生，研究方向：食品营养学研究；E-mail：tozjmail@163.com

王浩，男，博士，副教授，研究方向：食品营养学研究；E-mail：wanghao@tust.edu.cn