橡胶草高效再生体系的建立和优化

赵李婧， 李永梅， 曹新文， 马海霞， 闫 洁， 祝建波

(石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000)



橡胶草高效再生体系的建立和优化

赵李婧， 李永梅， 曹新文， 马海霞， 闫 洁*， 祝建波

(石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000)

摘要[目的]优化橡胶草再生和遗传转化体系。[方法]以橡胶草茎和叶为外植体，以1/2MS和MS为基本培养基，研究不同激素浓度配比、外植体类型和激素浓度对橡胶草不定芽诱导和生根的影响。[结果]橡胶草进行组织培养的最佳外植体类型为茎，诱导不定芽形成的最佳激素浓度配比为1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA。诱导不定芽生根的最佳激素浓度为0.10 mg/L NAA，生根率达100%，移栽成活率达95%以上。[结论]建立了橡胶草高效再生体系，对提高橡胶草组织培养的效率和转化率具有重要意义。

关键词橡胶草；组织培养；优化

橡胶草(Taraxacumkok-saghyzRodin)为菊科蒲公英属植物，又称俄罗斯蒲公英[1-2]，是一种产胶植物，其根中含有约20%的橡胶，其橡胶成分、结构、性能与巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)的橡胶相似。橡胶草作为可以替代橡胶树的一种植物，由于其生长周期短，具有良好的开发应用前景，是用来研究橡胶树产胶机理的模式植物。因此，研究橡胶草的再生体系和遗传转化体系是深入研究橡胶产胶机理的重要环节。

林伯煌等[3]以橡胶草的茎叶为外植体研究了橡胶草的组织培养，为人工培养橡胶草提供了先例。罗成华等[4-5]研究了橡胶草的离体培养，并建立了高效再生体系，为橡胶草无菌组织培养快速繁殖和遗传转化奠定了基础。罗成华等[6]研究了光质对橡胶草试管苗组织培养的影响，结果发现不同光质对愈伤组织的诱导有促进作用，而利用红蓝混合光对橡胶草外植体进行组织培养，外植体出芽率和丛生芽诱导率均增加，且玻璃化程度显著降低，移栽成活率提高。笔者分别以橡胶草茎和叶为外植体，对橡胶草再生和遗传转化体系进行了优化，对提高橡胶草组织培养的效率和转化率具有重要意义。

1材料与方法

1.1试验材料橡胶草植株于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖边，后移栽至石河子大学农业科学重点实验室进行室内培养,培养温度为(20±3)℃，光照强度为2 000 lx。

1.2培养基基本培养基为MS或1/2MS培养基，向基本培养基中添加不同浓度的琼脂、蔗糖和植物激素，pH为5.8～6.2,121 ℃高压灭菌15 min，在超净工作台内分装到培养皿或150 mL三角瓶中备用。

1.3试验方法

1.3.1不定芽的诱导。将橡胶草茎段剪成2 cm长，将叶剪成1 cm2的大小，将其接种至添加不同浓度植物激素的MS培养基中，设置浓度梯度为0.5、1.0、1.5 mg/L 6-BA和0.05、0.10、0.20 mg/L NAA，30 d后在橡胶草茎和叶片切口的愈伤处长出不定芽。将分化出芽的外植体接种至添加激素的MS培养基上继续培养。分别设置3个重复，于(20±3) ℃进行培养，观察不定芽的生长情况，统计不定芽的诱导率。诱导率=(出芽的外植体数/总接种的外植体数)×100%。

1.3.2外植体类型对橡胶草再生的影响。将生长良好的橡胶草无菌苗的茎剪成2 cm长、叶剪成1 cm2的大小，接种至添加1.0 mg/L 6-BA和 0.10 mg/L NAA的培养基中，观察并统计外植体的诱导率。

1.3.3不定芽生根的诱导。待不定芽长至4～5 cm时，将生长健壮的不定芽置于生根培养基中，培养温度为(20±3)℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为16～18 h/d。以1/2MS为基本培养基，向其中加入0、0.1、0.3 mg/L的NAA，每个处理接种25个不定芽，每个处理设置3个重复，取平均值，统计不定芽的生根情况，并观察不同浓度激素对不定芽生根的影响。

1.3.4组培苗的移栽。待根长15 cm左右时，向试管苗加入适量的水，松开封口膜置于栽培室放置1 d，将根系上的培养基洗干净，移栽至营养土中，营养土和蛭石的比例为3∶1，湿度为用力可以挤出水，25 d后统计成活率。

2结果与分析

2.1不定芽诱导的激素选择橡胶草不定芽诱导培养基试验结果表明，在添加不同浓度6-BA和NAA的培养基中，外植体分化时有明显差异，激素浓度越高，褐化现象和玻璃化程度越明显。将分化出芽的外植体接种于添加不同浓度6-BA和NAA的MS培养基中继续培养，发现随着6-BA浓度的增加，愈伤分化、丛生芽玻璃化和畸形苗形成的现象越严重，影响了芽的伸长生长；当NAA浓度较低时芽生长缓慢，且逐渐萎蔫死亡，浓度越高玻璃化程度越高，不利于芽的正常伸长生长。由表1可知，促进不定芽形成的最优水平组合为处理⑤，不定芽的平均诱导率为75.64%，不定芽诱导的最佳激素浓度配比为1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA(图1)。

注：A、B、C分别为添加1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA时，15、25和40 d时不定芽的生长情况。Note:A,B,C stands for growth situation of adventitions bud in the 15th,25th and 40th day respectively after adding 1.0 mg/L 6-BA and 0.10 mg/L NAA.图1　不定芽的诱导Fig.1　Induction of adventitious bud

Table 1Effects of different hormone concentration on adventitions bud regeneration

处理Treatment6-BAmg/LNAAmg/L平均诱导率Averageinductionrate∥%①0.50.057.34②0.50.1015.20③0.50.2017.53④1.00.0539.29⑤1.00.1075.64⑥1.00.2064.43⑦1.50.0553.36⑧1.50.1061.08⑨1.50.2048.52

2.2最佳外植体类型选择由表2可知，橡胶草叶的平均死亡率约是茎的2倍，茎的平均诱导率约是叶的3倍，达66.03%，因此，选择橡胶草的茎作为外植体进行后期试验。

表2外植体类型对橡胶草再生的影响

Table 2The influence of the explant types onTaraxacumkok-saghyzRodin regeneration

外植体类型Explanttypes死亡率Averagemortality∥%诱导率Averageinductionrate∥%叶Leaf27.8322.41茎Stem9.9666.03

2.3不同浓度NAA对不定芽生根的影响将橡胶草不定芽接种到生根培养基(1/2MS)中，结果发现，当培养基中不加NAA时，不定芽生长缓慢，部分生根且根生长缓慢多细密，继续培养发现组培苗叶开始泛黄，生长状况不佳(图2)；向培养基中加入0.1和0.3 mg/L的NAA，生根率高达100%，根壮实且主根明显，长势较好；但随着NAA浓度的增加，茎基部会分化出大块的愈伤，移栽后成活率较低。因此，选择最佳诱导生根的激素浓度为0.1 mg/L NAA(表3)。

注：A、B分别为添加0.1 mg/L NAA时，15和40 d的生长情况。Note:A、B stands for the 15th and 40th day growth situation after adding 0.1 mg/L NAA.图2　不定芽的生根Fig.2　 Adventitious bud rooting

2.4组培苗的移栽当根长15 cm左右时，将练苗1 d的橡胶草无菌苗移栽到湿度适宜的营养土中，待覆膜生长7 d后，发现橡胶草生长状况良好，移栽后成活率达95%以上(图3)。

注：A、B均为移栽后40 d的生长情况。Note:A,B is growth situation after transplanting for 40 days.图3　橡胶草的移栽苗Fig.3　The transplanting of Taraxacum kok-saghyz Rodin

3结论与讨论

植物组织离体的分化、脱分化和再分化是一个复杂的变化，此变化受到多种因素的影响，包括植物激素类型、激素浓度、不同激素的浓度配比、外植体类型等。在橡胶草的再生培养中，主要采用的激素为6-BA和NAA[7-10]，外植体主要是地上部分。该研究结果表明，1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA影响橡胶草外植体诱导不定芽，促进外植体从愈伤直接分化出不定芽，0.10 mg/L NAA可以促进不定芽生根，保证无菌苗生长状态良好。

在橡胶草组织培养过程中，利用之前的诱导培养基在诱导不定芽伸长生长时愈伤分化和玻璃化现象较严重，降低了不定芽的质量和诱导率。NAA浓度较高时，不定芽形成的根多以须根为主，无主根，而茎基部常形成大块的愈伤，在移栽时根易随着愈伤的破碎而脱落，降低了移栽成活率。

表3　不同浓度NAA对不定芽生根的影响

该试验结果表明，在橡胶草不定芽诱导形成中，高浓度的6-BA可以促进愈伤的形成，低浓度的NAA有利于不定芽的生长和根的形成。该试验中，6-BA浓度降低后减小了芽伸长过程中愈伤过度分化对芽生长造成的影响，减少了丛生芽的玻璃化和畸形芽的形成，有效提高了芽的诱导率和质量；低浓度的NAA有利于不定芽的形成。在MS培养基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA时，橡胶草不定芽能够高效、高质量地进行繁殖。高质量的不定芽是生根的重要条件之一，生根时选用健壮、生长良好的不定芽进行诱导生根培养， NAA浓度降低后，诱导不定芽形成了主根，减少了生根过程中茎基部愈伤的形成，提高了移栽成活率。该试验结果表明，最佳诱导芽生根的激素浓度为0.1 mg/L NAA。

外植体类型的选择是建立再生体系的另一个重要因素，同一植株的不同器官、同一器官的不同生长时期，其分化和再分化的能力均有差别[11-13]。因此，进行组织培养时，选取合适的外植体是保证组织培养成功的另一个重要因素。该试验结果表明，以橡胶草的茎作为外植体进行组织培养，分化出的不定芽质量更高，有利于后期不定芽生根的培养，提高移栽成活率。

该试验结果表明，在调整诱导培养基的激素浓度配比后，橡胶草分化出主根，茎基部愈伤分化明显减少，因此在炼苗后的移栽过程中发现，此种根的苗移栽成活率达95%以上。

参考文献

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Establishment and Optimization of High Efficient Regeneration System ofTaraxacumkok-saghyzRodin

ZHAO Li-jing, LI Yong-mei, CAO Xin-wen et al

(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000)

Abstract[Objective] The aim was to optimize Taraxacum kok-saghyz Rodin regeneration and genetic transformation system.[Method] With stems and leaves of T.kok-saghyz as explants, 1/2MS and MS as the basic medium, effects of different hormone concentrations and explant types on adventitious bud induction and rooting were studied.[Result] The results showed that the best explant for tissue culture was stem, the best hormone concentration ratio of adventitious bud induction was 1.0 mg/L 6-BA and 0.10 mg/L NAA, and the adventitions bud was healthy.The most suitable hormone concentration for adventitious bud rooting was 0.10 mg/L NAA with 100% rooting rate and 95% survival rate.[Conclusion] The established high efficient regeneration system of T.kok-saghyz has significance on improving tissue culture efficiency and transformation ratio.

Key wordsTaraxacum kok-saghyz Rodin; Tissue culture; Optimization

基金项目国家自然科学基金项目(31360060)。

作者简介赵李婧(1989- )，女，山西晋城人，硕士，研究方向：植物基因工程。*通讯作者，副教授，博士，从事生物化学和分子生物学教学和科研工作。

收稿日期2016-03-08

中图分类号S 576

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)10-230-02