SLIT2在肾透明细胞癌组织中的表达及意义

孟杰 张亮 张春煜

SLIT2在肾透明细胞癌组织中的表达及意义

孟杰 张亮 张春煜

目的 探讨神经迁移蛋白SLIT2蛋白在肾癌中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学方法检测80例肾透明细胞癌及对应的癌旁2cm肾组织中SLIT2蛋白的表达情况，结合临床病例资料分析其临床病理意义。结果 （1）在肾透明细胞癌组织及对应的癌旁2cm肾组织中，SLIT2蛋白的阳性表达率分别为28.8%（23/80）和76.3%（61/80），组间差异有统计学意义（P＜0.01）；（2）SLIT2蛋白的表达与肾透明细胞癌组织分级、肿瘤TNM分期及有无淋巴结转移有关（P＜0.05），而与肾癌患者的性别、年龄，肿瘤大小无关。结论 研究结果支持SLIT2在肾癌的发生、发展过程中发挥了一定作用，检测SLIT2蛋白的表达有助于判定肾透明细胞癌的生物学行为。

肾透明细胞癌；SLIT2；免疫组织化学

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人民生命健康，在肾癌的多种亚型中，以肾透明细胞癌最为常见，约占肾癌总数的70%～80%[1]。神经迁移蛋白SLIT2是近年来发现的一个肿瘤相关因子，其在多种肿瘤发生发展中的表达及意义成为研究热点。本实验应用免疫组化方法检测了RCCC组织中SLIT2的蛋白表达情况，分析了 SLIT2的表达与临床病理参数之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集辽河油田总医院2011年1月～2014年12月间肾癌根治切除的病理标本80例，经病理医师诊断，所有肾癌组织学类型均为肾透明细胞肾细胞癌。所有患者术前未作放、化疗，年龄31～83岁，中位年龄58岁。80例肾癌中，男50例，女30例；组织核分级：I级35例，II级23例，III级20例，Ⅳ级2例；有淋巴结转移者42例，无淋巴结转移者38例；按照国际抗癌联盟（UICC）TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期16例，Ⅲ期28例，Ⅳ期6例，并取对应的80例癌旁2cm肾脏组织，所有标本均经10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，分别做HE染色与免疫组化染色。

1.1.2 试剂 兔抗人单克隆anti-SLIT2抗体（稀释浓度为1︰75）为武汉博士德公司产品；PV-9000免疫组化试剂盒、DAB显色剂（购自中衫金桥生物技术有限公司）。

1.2 方法 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学PV-9000二步法。组织蜡块4μm切片后放置70℃的烤箱内烘干2h，然后进行脱蜡脱水处理。滴加3% H2O230min以灭活内源性过氧化物酶。抗原高温高压热修复后（95℃～100℃），于室温下自然冷却，然后PBS冲洗3次，每次3min。滴加3%的过氧化氢溶液，完全覆盖组织，室温下封闭放置20min，以阻断内源性过氧化物酶活性，然后用PBS冲洗3次，每次3min。滴加一抗，4℃冰箱过夜；PBS液冲洗3min×3次，滴加试剂1（增强剂），37℃温箱内孵育40min；PBS液冲洗2min×3次，滴加试剂2（辣根酶标记的羊抗鼠IgG多聚体），37℃温箱内孵育30min；PBS液冲洗2min×3次，DAB显色，蒸馏水冲洗、苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。用已知阳性组织切片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定 SLIT2蛋白定位于胞浆（见图1），参考相关文献对其表达进行评分[2]，以细胞浆中出现黄至棕黄色颗粒为阳性显色，以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达。光镜下每张切片中选取癌细胞较多的5个高倍视野，每个视野计数100个细胞。染色强度分级如下：无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；阳性细胞数分级为：无阳性细胞为0，阳性细胞数≤10%为1，11%～50%为2，51%～75%为3，≥76%为4。两项得分相乘结果≥3为阳性表达病例。

图1 SLIT2在肾透明细胞癌中的阳性表达（PV法×200）

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。各组间率的比较使用χ2检验或校正的χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SLIT2蛋白在肾透明细胞癌癌和癌旁2cm肾脏组织中的表达情况 在80例肾透明细胞癌标本中，SLIT2蛋白的阳性表达率分别为28.8%，癌旁2cm肾脏组织中SLIT2蛋白阳性表达率为76.3%，2组间有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 SLIT2蛋白在肾透明细胞癌的表达情况及与临床病理参数的关系 肿瘤分级Ⅰ+Ⅱ组、肿瘤分期Ⅰ+Ⅱ组及无淋巴结转移组，SLIT2蛋白的表达量显著增高，且差异有统计学意义(P＜0.05)。而SLIT2蛋白的表达与肾透明细胞癌患者的性别、年龄及肿瘤大小无关。见表2。

表1 SLIT2蛋白在肾透明细胞癌癌和癌旁2cm肾脏组织中的表达(n=80)

表2 SLIT2蛋白表达与肾透明细胞癌临床病理特征的关系

3 讨论

SLIT是Nusslein Volhard等于1984年在果蝇体内发现的分泌型的细胞外基质蛋白，由胶质细胞中线合成，后续的研究发现，在果蝇的中央神经中也存在该蛋白。哺乳动物体内的SLIT包含3种亚型即Slit1、Slit2、Slit3,均在神经系统表达,后二者还存在于其他细胞中[3]。该基因位于染色体4p15.2上,SLIT2是一组相对分子量为170KD～190KD的细胞外分泌蛋白。目前SLIT2在肿瘤的研究尚处于探索阶段，其对肿瘤的作用也存在争议。一些研究显示，SLIT2蛋白在多种肿瘤组织中表达下调。黄小莉[4]等应用组织芯片与免疫组化技术法检测55例SCC、30例CINⅠ～Ⅱ级、30例CINⅢ级及20例NCE中Slit2蛋白的表达情况，结果显示，随着宫颈病变恶性程度的提高，SLIT2蛋白的表达逐渐下降。Dong[5]等通过检测卵巢癌组织中SLIT2甲基化的情况发现，与正常卵巢组织相比，卵巢癌组织中，SLIT2甲基化的频率大大增多，使其在卵巢癌组织中蛋白表达减少，且该研究还发现，在早期卵巢癌中，这一现象便可检测到，提示SLIT2甲基化可以成为检测卵巢癌发生的标志。Tseng[6]等通过对人类及动物的食道癌组织研究发现，SLIT2蛋白在食道癌组织中呈低表达，并与患者预后密切相关，提示该基因是一个肿瘤转移抑制因子，并可作为判断肿瘤患者预后的新指标。然而，也有一些研究显示出了相反的结果，发现SLIT2在肿瘤组织中表达增加，提示该基因有促进肿瘤生长的作用。王等对多种肿瘤组织中SLIT2蛋白进行了检测，如乳腺癌、肠癌、胃癌等，并与之正常组织相对比，结果发现在这些恶性肿瘤中，SLIT2蛋白表达量增高[7]。Latil[8]等采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对48例前列腺癌及7例正常前列腺组织进行检测，结果发现在前列癌组织中SLIT1、SLIT2、SLIT3及其受体Robo的表达都增加。

应用免疫组化方法检测SLIT2蛋白在肾透明细胞癌组织及癌旁2cm肾脏组织中的表达情况，探讨其在肾癌发生、发展中的作用。实验结果显示，SLIT2蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达显著低于癌旁肾组织中的表达，提示SLIT2蛋白的表达缺失可能参与了肾癌的发生。Ma等[9]通过对肾癌的研究发现，相比于癌旁配对组织，肾癌中SLIT2蛋白表达和mRNA表达水平都显著下降，甲基化特异性PCR显示，SLIT2启动子在肾癌发生甲基化的频率大大增加，提示该基因在肾癌组织中由于发生甲基化，从而使其蛋白表达下调。此外，本试验结果还显示，SLIT2蛋白在肿瘤分级Ⅰ+Ⅱ级、肿瘤分期Ⅰ+Ⅱ期及无淋巴结转移组表达量较肿瘤分级Ⅲ+Ⅳ级、肿瘤分期Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴结转移组高，且差异有统计学意义（P＜0.05）；而SLIT2蛋白的表达与肾癌患者的性别、年龄、肿瘤大小无关。这些结果提示TSG101蛋白的表达降低可能促进了肾癌的发生，这些结果也支持TSG101作为一个潜在的抑癌基因在肿瘤发生、发展了发挥了一定作用。

综上所述，SLIT2基因与肾癌的恶性进展有密切联系，在其发展过程中起到重要作用。

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Objective To investigate the expression and the clinical pathological significance of SLIT2 protein expressed in renal clear cell adenocarcinoma (RCCC). Methods The expression of SLIT2 proteins was detected by immunohistochemistry in 80 cases of renal clear cell adenocarcinoma and its adjacent 2cm tissues. Results (1) the SLIT2 positive rates of protein were 28.8% (23/80） and 76.3% (61/80) in renal clear cell adenocarcinoma and matched adjacent 2cm tissues respectively. Significant differences statistically were obtained between the group of renal clear cell adenocarcinoma and the group of adjacent 2cm tissues (P＜0.01). (2) Higher positive rates of SLIT2 protein was found in the group of tumor gradeⅠ+Ⅱ, TNM Ⅰ+Ⅱ and non-lymph node metastasis than that of in the group of tumor grade Ⅲ+Ⅳ, TNM Ⅲ+Ⅳ and lymph node metastasis (P＜0.05), but no significant differences statistically was obtained among the groups of gender age and tumor size. Conclusion It was suggested that SLIT2 might be contribute to the progression of renal clear cell carcinoma and investigation of the expression of SLIT2 proteins might be advantageous to the judgment of biological behaviors in the renal clear cell carcinoma.

Renal clear cell adenocarcinoma; SLIT2; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.9.004

辽宁 124010 辽河油田总医院 (孟杰 张亮 张春煜)

张春煜 E-mail:2311418579@qq.com