紫外诱变复合重金属离子抗性突变选育螺旋霉素高产菌株

刘守强，赵　中，刘　果，周淑梅，李爱玲，王留国

(1.天方药业有限公司，河南 驻马店 463000；2.黄淮学院数学科学系，河南 驻马店 463000；3.驻马店市环保局，河南 驻马店 463000)



紫外诱变复合重金属离子抗性突变选育螺旋霉素高产菌株

刘守强1，赵中2，刘果1，周淑梅3，李爱玲1，王留国1

(1.天方药业有限公司，河南 驻马店 463000；2.黄淮学院数学科学系，河南 驻马店 463000；3.驻马店市环保局，河南 驻马店 463000)

摘要：以螺旋霉素链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)YL0113-01为出发菌株，采用紫外线诱变，并以重金属Co2+为筛选因子，获得一株遗传稳定且螺旋霉素发酵效价比出发菌株提高6%的菌株。再对该菌株采用亚硝基胍(NTG)诱变，以缬氨酸结构类似物L-α-氨基丁酸作为筛选因子得到一株发酵效价较出发菌株提高14%的菌株。

关键词：螺旋霉素；亚硝基胍诱变；紫外线诱变；重金属Co2+；L-α-氨基丁酸

螺旋霉素是一种广谱抗生素，主要用于治疗革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌、立克次氏体及大型病毒所引起的感染[1]。在临床应用多年后，对感染性疾病的治疗仍然有效，个别领域还有拓展的空间[2]。因此，提高螺旋霉素的工业化水平十分重要。

诱变育种是利用物理、化学等因素诱发生物体产生突变，从中筛选、培育动植物和微生物新品种的方法。诱变随机育种在菌种选育史上创造了辉煌的业绩，但有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质尚难控制。因此，提高诱变效率、迅速鉴定和筛选突变体以及探索定向诱变的途径是当前研究的重要课题。

螺旋霉素链霉菌生物合成螺旋霉素的过程受许多酶的调控。酰基激酶和酰基CoA合成酶是螺旋霉素内酯环合成的重要酶，Co2+、Mn2+对酰基激酶和酰基CoA合成酶有较强的激活作用[3]，通过选育耐受高浓度Co2+的突变株，增加酰基激酶和酰基CoA合成酶活力，进而提高螺旋霉素内酯环合成能力，达到提高生产能力的目的。作者采用诱变与定向筛选相结合的方法筛选螺旋霉素链霉菌高产菌株，即根据螺旋霉素生物合成途径的调控机制和本身的分子结构特点，采用紫外线和亚硝基胍(NTG)进行诱变，对重金属离子和缬氨酸耐性突变型菌株进行筛选，以获得高产菌株。

1实验

1.1菌种、培养基和培养条件

螺旋霉素链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)YL0113-01，天方药业有限公司。

平板、斜面培养基(%)：玉米淀粉4，淀粉酶0.03，黄豆饼粉1，氯化钠0.4，七水硫酸镁0.05，碳酸钙0.5，琼脂2。平板菌落28 ℃培养12d后，挑选单菌落接种到斜面培养基中，28 ℃培养12d。

种子培养基(%)：淀粉4，黄豆饼粉1，蛋白胨 0.5，氯化钠0.2 ,玉米浆0.5，pH值6.7。将成熟斜面孢子挖块接种到种子培养基中，置于旋转式摇瓶机上于220r·min-1、28 ℃培养48h。

摇瓶发酵培养基(%):淀粉5，鱼粉1.5，玉米浆1.5，磷酸二氢钾0.3，黄豆饼粉1.0，氯化钠0.6，硝酸铵0.5，硫酸镁0.05，豆油0.3，pH值6.7。取种子培养液10%(体积分数)移种于发酵培养基中，于旋转式摇瓶机上220r·min-1、28 ℃培养96h。

1.2高产菌株的诱变与筛选

1.2.1紫外线照射诱变处理

单孢子菌悬液制备：将成熟新鲜斜面孢子用铲子刮下，接种到含无菌生理盐水及玻璃珠的瓶子中，充分摇动5min，使孢子尽可能分散，然后经灭菌后的单层擦镜纸过滤，制得单孢子菌悬液用于诱变处理。

紫外线照射诱变：吸取单孢子菌悬液6mL于含磁针的平板中，置于30W的UV灯(253.7nm)下30cm处，振动照射处理，杀死率控制在90%左右。然后转入含1.2mmol·L-1Co2+的琼脂培养基中于28 ℃避光培养12d，挑取长出的单菌落进行摇瓶初筛、复筛，考察效价，获得高产突变菌株。

1.2.2NTG化学诱变处理

将获得的高产菌株斜面孢子涂布于含NTG的梯度培养基平板上，28 ℃培养12d，挑选NTG梯度高的一侧刚好长出的菌落于含L-α-氨基丁酸(浓度为0.6mg·mL-1)的种子培养基中，28 ℃培养48h后稀释涂布于培养基平板上，28 ℃再培养12d，挑取长出的单菌落进行发酵效价考察。

1.3发酵液的效价测定

螺旋霉素化学效价测定采用硫酸水解法，螺旋霉素在231～232nm波长处有紫外吸收峰，本身带有发色基团，遇浓硫酸或盐酸反应后呈紫色，并在480nm处有最大吸收峰，可定量测定。

2结果与讨论

2.1Co2+用于筛选螺旋霉素高效价菌株

2.1.1菌株对重金属Co2+的耐受浓度考察

向种子培养基中添加不同浓度的Co2+，考察菌株YL0113-01的生长情况，结果见表1。

表1菌株YL0113-01在含不同浓度

Co2+培养基中的生长情况

Tab.1　Growth of strain YL0113-01 in medium

由表1可知，当Co2+浓度较低时，不影响菌株的生长，种子液菌浓正常；当Co2+浓度达到1.2 mmol·L-1时，就开始对菌株生长有了抑制作用，摇瓶外观较稀，挂壁较少；当Co2+浓度过高时，则明显抑制菌株的生长。1.2 mmol·L-1浓度的Co2+已影响了菌株的代谢过程，因此，可以利用这个敏感浓度位点对菌株进行诱变后的筛选，以得到高产螺旋霉素的突变菌株。

2.1.2耐受Co2+突变菌株的筛选

将经紫外线照射后的单孢子菌悬液加到含1.2 mmol·L-1Co2+的琼脂培养基中于28 ℃避光培养12 d，挑取长出的单菌落进行摇瓶初筛、复筛，考察效价。经摇瓶初筛，只有2株单菌落发酵效价高于出发菌株 YL0113-01。将所得的2株菌株进行摇瓶复筛后再分离纯化得到1株比出发菌株YL0113-01效价提高6%的突变菌株。

2.2NTG诱变获得耐受高浓度L-α-氨基丁酸的突变菌株

缬氨酸等氨基酸代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸，L-缬氨酸提供螺旋霉素内酯环中丁酸和丙酸单位，能刺激螺旋霉素的生物合成[4]。 L-α-氨基丁酸是螺旋霉素前体的结构类似物，用来定向筛选耐前体的突变菌株。以2.1.2筛选得到的高产菌株为出发菌株，用NTG诱变，经L-α-氨基丁酸筛选后挑取长出的单菌落进行摇瓶效价考察，得到5株发酵效价比出发菌株高6%的突变菌株，对其进行分离纯化，摇瓶复筛后获得1株发酵效价比NTG诱变前提高8%的突变菌株YL0235-06。

2.3突变菌株分离纯化及菌落形态变化

对经抗性选育得到的高产螺旋霉素突变菌株YL0235-06相继进行2次自然分离，得到菌落结构紧密、形态单一、产量较高的菌株YL0240-05，并用于后

续的生产性实验。

通过对YL0240-05和YL0113-01菌落外观对比，发现两者间有较大差异，YL0113-01呈圆形、规则、有凸起菌落，而 YL0240-05菌落中央凸起，呈对称性放射褶皱状。

2.4高产菌株遗传稳定性考察

用群体连续传代的方法考察菌株YL0240-05的传代稳定性。通过连续三代斜面传代并进行效价考察发现，该菌株三代间效价波动幅度小,第三代斜面效价是第一代斜面效价的98%。说明菌株YL0240-05的高产遗传特性稳定。

3结论

采用紫外线照射、亚硝基胍化学处理螺旋霉素链霉菌YL0113-01菌株，通过重金属离子和缬氨酸的推理选育方法，经过多次分离筛选最后获得YL0240-05高产突变菌株，其发酵效价比出发菌株累计提高14%，达到预期目的。

参考文献：

[1]吴亚铭.硝酸铵添加量对螺旋霉素发酵影响的初探[J].现代应用药学，1992,9(5):221.

[2]朱峰，王尔健．螺旋霉素的再评价[J]．中国抗生素杂志，1991,16(3):231-236.

[3]李友元,陈长华,李永东,等.酰基激酶和酰基CoA合成酶对螺旋霉素合成的影响[J].华东理工大学学报,2001,27(3):251-253.

[4]LEBRIHI A，LAMSAIF D，LEFEBVRE G,et al.Effect of ammoniumions on spiramycin biosynthesis inStreptomycesambofaciens[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1992，37(3):328.

Screening Spiramycin High-Producing Strain with UV and Heavy Metal Ion Resistance Mutation

LIU Shou-qiang1，ZHAO Zhong2，LIU Guo1，ZHOU Shu-mei3，LI Ai-ling1，WANG Liu-guo1

(1.TopfondPharmaceuticalCo.，Ltd.，Zhumadian463000，China；2.DepartmentofMathematicalSciences，HuanghuaiUniversity，Zhumadian463000,China；3.EnvironmentalProtectionBureauofZhumadian，Zhumadian463000，China)

Abstract：A parent strain Streptomyces spiramyceticus YL0113-01 was treated by UV and using heavy metal Co2+as a screening factor.A stable strain was obtained with fermentation titer increased by 6% than parent strain.Then the mutant was treated by NTG with L-α-amino-butyric acid(an analogue of valine) as a screening factor,and a strain with fermentation titer increased by 14% than parent strain was obtained.

Keywords：spiramycin；nitrosoguanidine mutation；UV mutation；heavy metal Co2+；L-α-amino-butyric acid

基金项目：NSFC-河南人才培养联合基金资助项目(U1304104)

收稿日期：2016-01-16

作者简介：刘守强(1967-)，男，河南确山人，高级工程师，从事抗生素发酵工艺研究，E-mail：junzhongzhongxin01@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.05.006

中图分类号：TQ 465.5

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)05-0026-02