肝癌患者与健康人外周血Vγ9Vδ2T细胞扩增前后比例及分化亚型对比

马 俊 赵浩亮 田 伟 贺杰峰 李高鹏

肝癌患者与健康人外周血Vγ9Vδ2T细胞扩增前后比例及分化亚型对比

马 俊 赵浩亮 田 伟 贺杰峰 李高鹏

目的 探讨肝细胞癌（HCC）患者外周血的Vγ9Vδ2T细胞比例，成熟分化亚型与健康人的差别，经体外扩增后上述指标的变化。方法 选取健康捐献者（n=10）和HCC患者（n=20）的外周血共10mL，采用不连续密度梯度离心法分离单核细胞层，借助流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞占总T细胞比例，成熟分化亚型，并在体外加入唑来膦酸和IL-2进行扩增培养，12～14d后收集细胞再次检测上述指标。结果 培养前HCC组患者外周血中Vγ9Vδ2T细胞占总T细胞比例的平均值比健康人低（P<0.05，P=0.009），在经过体外扩增培养后其比例明显升高（P<0.0001），而在体外扩增后患者与健康人的Vγ9Vδ2T细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05，P=0.3408）。患者Vγ9Vδ2T细胞的分化与成熟亚型作体外培养的前后对比发现，培养后Tn、Tcm、Temra的比例较培养前有明显下降（P<0.05，P=0.0045，P=0.0236，P=0.0162）；患者和健康人Tem比值均较培养前明显升高（P<0.0001）；而在扩增前、扩增后患者和健康人的Vγ9Vδ2T细胞的成熟分化比例差异均无统计学意义。结论 肝癌患者外周血Vγ9 Vδ2T细胞比例虽然低于健康人，但其分化成熟亚型的分布比例与健康人相似，且经过体外扩增培养后Vγ9Vδ2T细胞和总效应细胞比例，均与健康人无差异。其增殖功能得到恢复，肝癌患者和健康人中应用这种体外扩增方法外周血Vγ9Vδ2T细胞的效果相似。

肝细胞癌；Vγ9Vδ2T细胞；过继免疫治疗；唑来膦酸

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均居前列[1]，虽然已逐步形成外科手术、局部消融治疗，放化疗、经肝动脉或门静脉灌注化疗等综合治疗模式，但是肝癌转移、复发问题仍未完全解决。随着分子免疫和生物学的发展，生物免疫治疗日益受到关注，尤其是以γδT细胞为基础的过继性细胞治疗免疫应用在肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、乳腺癌等多种实体肿瘤的细胞和临床实验中取得具有显著疗效而成为研究热点[2]。

γδT细胞根据δ链的亚型可分为Vδ1 T细胞和以Vγ9Vδ2T细胞为主的Vδ2 T细胞。其中Vδ2 T细胞主要参与人体免疫反应和防御功能。据对细胞表面标志物和细胞因子刺激而发生增殖和分化的功能不同，Vγ9Vδ2T细胞又可分为幼稚型(Tn，CD45RA(+)CD27(+))、中心记忆型[Tcm，CD45RA(-)CD27(+)]、效应记忆型[Tem，CD45RA(-) CD27(-)]和终末分化型[Temra，CD45RA(+)CD27(-)]4型。其中Tem和Temra主要分布于感染及肿瘤组织部位，在人体内抗感染和抗肿瘤免疫方面起主要作用[3]，称之为总效应型。而γδT细胞总效应型的变化必然影响到其免疫功能的状态。研究发现，肝癌患者体内持续存在严重的免疫抑制现象[4]，这种免疫抑制状态是否和到γδT细胞有相关，进而导致肝癌的发展和转移，我们不得而知，所以本研究旨在将肝癌患者外周血的Vγ9Vδ2T细胞比例、分化亚型与健康人对比和分析，以期初步了解肝癌患者体内的某些免疫状态。并在体外使用唑来膦酸加IL-2扩增γδT细胞[5]，并与健康人对比分析，了解肝癌患者外周血γδT细胞增殖能力和增殖后细胞亚型，为进一步研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 HCC患者（n=20）和健康捐献者（n=10）在被告知知情同意书后登记入名单，患者纳入标准为经病理诊断或临床诊断标准（原发性肝癌诊疗规范(2011年版)，中华人民共和国卫生部）[6]确诊的原发性肝癌患者，无全身免疫疾病，既往无全身化疗史。材料：Ficoll分离液，美国GE Healthcare公司；GT-T551淋巴细胞培养基，日本TaKaRa公司；0.4% Trypan Blue Stain，美国Life Technologies公司；无菌PBS，武汉博士德生物工程有限公司；CD3-PC5，美国eBioscience公司；TCR-Vγ9-PE，CD45RA-FITC，CD27-PC7，美国BD Biosciences公司；TCR-γδ-FITC，美国Beckman Coulter公司；唑来膦酸，瑞士诺华制药有限公司；IL-2，北京四环生物制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Vγ9Vδ2T细胞的分离 清晨取健康志愿者和HCC患者的外周血2份，每份5mL，3000转/min(RPM)离心5min，用等量生理盐水稀释后，轻轻加于(Ficoll)淋巴细胞分离液(5mL)上，2000r/min离心20min，取中间层细胞，生理盐水洗2遍后，计细胞数。

1.2.2 Vγ9Vδ2T细胞与分化表型鉴定 收集分离出的淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，每个样本取100μL个2份，按抗体说明书于第1管加入CD3-PC5抗体，TCRVγ9-PE抗体，TCR-γδ-FITC抗体；于第2管加入CD3-PC5抗体，CD45RA-FITC抗体，CD27-PC7抗体，4℃避光孵育20～30min，PBS洗2次，用PBS 500μL重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

1.2.3 Vγ9Vδ2T细胞体外培养 在山西省肿瘤医院的特定GMP级实验室的药品生产质量管理规范条件下进行细胞制备和培养，用GT-T551淋巴细胞培养基（添加灭活的自体血清，庆大霉素）进行培养，37℃，5% CO2培养箱中培养。培养第1天加入唑来膦酸5μmol/L和人重组IL-2 1000IU/mL，每2～3天观察细胞增殖情况，根据细胞培养情况加入10mL新鲜培养基（含人重组IL-2 1000IU/mL），培养12～14d收获γδT细胞。

1.2.4 培养后Vγ9Vδ2T细胞的鉴定和亚型检测 收集培养的细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，再次采用流式细胞仪进行Vγ9Vδ2T细胞与分化表型鉴定，方法同前。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件进行统计分析，计量资料采用“x±s”表示，配对样本间比较采用配对t检验方法，非配对样本间比较采用非配对t检验方法，P<0.05（双尾）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在整个培养过程中，健康人组10例全部培养成功，无细胞污染。患者组20例有2例经过培养后细胞无扩增，未能收获细胞。HCC患者外周血中Vγ9Vδ2T细胞占总T细胞比例的平均值在培养前比健康人低（P<0.05），在经过体外药物扩增培养后其比例明显升高（P<0.05），与健康人相比差异无统计学意义。见图1A、图2。

2.2 Vγ9Vδ2T细胞成熟分化亚型分析 培养前测定患者外周血中Tn、Temra、Tcm、Tem的比例与健康人相比差异无统计学意义。见图1B。在经过体外药物扩增培养后与健康人相比，患者Vγ9Vδ2T细胞成熟分化亚型Tn、Temra、Tcm、 Tem的比例差异无统计学意义。见图1C。即在扩增前、后患者和健康人2组之间的Vγ9Vδ2T细胞的成熟分化比例差异均无统计学意义。而患者的Vγ9Vδ2T细胞的分化亚型体外扩增前、后对比发现。见图1D。Tn的比例在培养后较培养前有明显下降（P<0.05），Tcm比例在培养后较培养前下降（P<0.05），患者和健康人的Tem比值均较培养前明显升高（P<0.05），患者和健康人的Temra比例均较培养前下降（P<0.05），总效应型较扩增前明显升高（P<0.05）。见表1。

图1 A 肝癌患者与健康人扩增前、后Vγ9Vδ2T细胞/总T细胞比例；图1B 肝癌患者与健康人扩增前Vγ9Vδ2T细胞成熟分化亚型比例；图1C肝癌患者与健康人扩增后Vγ9Vδ2T细胞成熟分化亚型比例；图1D 肝癌患者扩增前、后Vγ9Vδ2T细胞成熟分化亚型比例(x×s，P＜0.05)

图2 Vγ9Vδ2T细胞扩增前后典型流式细胞图

3 讨论

肿瘤的发展不是独立事件，其中免疫逃逸与免疫抑制对肿瘤的发展具有十分重要的作用。我们发现在先天或获得性免疫缺陷的患者中诱发或自发肿瘤的发生率明显高于健康人，这个证据证明当机体的免疫监视和防御功能被抑制或低下时，可能发生患者体内局部肿瘤细胞的免疫逃逸[7]。肝癌是一种免疫原性弱的肿瘤，其肿瘤细胞具有免疫逃避和对机体免疫系统的抑制作用，机体自身的免疫系统和免疫细胞会受到抑制和忽视肿瘤细胞，所以直接输入具有直接特异免疫力的过继性细胞治疗可以避免患者机体内的免疫抑制环境，而起到直接杀伤肿瘤细胞的作用，而且其可以与手术、化疗、区域灌注化疗、免疫调节剂等联合或辅助使用，具有广阔的前景[8]。

表1 肝癌患者与健康人扩增前后Vγ9Vδ2T细胞/总T细胞比例，Vγ9Vδ2T细胞成熟分化亚型比例（x±s，%）

研究证实，磷酸抗原激活Vγ9Vδ2T细胞是目前γδ T细胞为基础的抗肿瘤研究最常用方法[9]。Nicol AJ等[5]发现健康捐献者的Vγ9Vδ2T细胞在体外培养时同时使用唑来膦酸加上IL-2时会大量扩增，但是对来自恶性肿瘤患者的Vγ9 Vδ2T细胞在体外扩增其扩增的倍数和扩增比例是有差异的，他们将患有各种不同肿瘤如肺癌、肾癌、黑色素癌甚至转移癌等患者按临床效果评价体系分成高反应和低反应组，发现低反应组在扩增前后Vγ9Vδ2T细胞的比例、倍数与健康人和高反应组相比明显降低。而在扩增前分化与成熟亚型对比上是有差异的，其Tn和Temra明显高于健康人和高反应组，并且提示其差异与Vγ9Vδ2T细胞扩增结果有相关性，而高反应组在扩增前成熟分化亚型的比例分布和扩增能力与健康人无差异，证明部分肿瘤患者体内Vγ9Vδ2T细胞数量，亚型及功能与健康人一致。本研究采用相同的扩增方法，结果提示肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T细胞占总T细胞的比例比健康人低，提示肝癌患者体内可能存在免疫抑制，而在培养后细胞比例与健康人无差异，提示Vγ9Vδ2T细胞在体外脱离免疫抑制后，其扩增能力得以恢复。肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T细胞成熟分化比例在培养前与健康人相比差异无统计学意义，而在培养前后患者和健康人的Vγ9Vδ2T细胞的成熟分化比例同样差异均无统计学意义，说明患者Vγ9Vδ2T细胞各分化亚型的扩增能力与健康人无差异，而扩增前后对比发现Tem显著升高，Temra下降，而Tem和Temra之和，即总效应型是升高的，且患者与健康人培养后比值无差异，说明肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T细胞经过体外培养后在杀伤肿瘤细胞的效应细胞比值增加趋势和程度与健康人一致，所以从具有杀伤肿瘤细胞功能的有效细胞比例上能够在扩增后与健康人达到相同的效果，上述结果与证明肝癌患者外周血中Vγ9Vδ2T细胞在脱离体内免疫环境后经体外使用唑来磷酸钠和IL-2后其增殖能力得以恢复，其分化成熟亚型和比例与健康人无差异，这与NicolAJ等结果一致。

研究表明，肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T细胞虽然在低于正常人的比例，但其分化成熟亚型与健康人相似，且经过体外扩增培养后，其比例分布趋势与健康人无差异，说明繁殖功能得到恢复，所以本文初步说明HCC患者进行体外Vγ9Vδ2T细胞是可行的，为未来过继免疫治疗的免疫细胞来源提供一定依据，当然，培养后的细胞能否杀伤特异的肝癌肿瘤细胞，还需要做细胞共培养杀伤实验以及动物实验。另外外周T细胞的亚型很多，除了起到免疫防御的免疫识别和效应细胞外，还有好多其他功能的细胞，比如具有免疫抑制作用的等调节性T细胞(Treg细胞)[10]等，作为存在于外周血中的重要的免疫抑制细胞，其在肝癌患者体内的比例与健康人是否有差异，以及经体外扩增后Treg细胞是否也随之大量扩增从而起到更为严重的免疫抑制作用，这些情况我们均不清楚，还需要进一步研究。

[1] Bruix J,Sherman M.American association for the study of liver diseases. Management of hepatocellular carcinoma:an update[J].Hepatology, 2011,53(3):1020-1022.

[2] Li Z,Peng H,Xu Q,et al.Sensitization of human osteosarcoma cells to Vγ9Vδ2 T-cell-mediated cytotoxicity by zoledronate[J].J Orthop Res，2012，30(5):824-830.

[3] Caccamo N,Meraviglia S,Ferlazzo V,et al.Differential antigen or homeostatic cytokines for proliferation and requirements differentiation human Vgamma9Vdelta2 naive,memory and effector T cell subsets[J].Eur J Immunol,2005,35(6):1764-1772.

[4] Gao Q,Qiu SJ,Fan J,et al.Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T cells is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma after resection[J].J Clin Oncol,2007,25(18):2586-2593.

[5] Nicol AJ,Tokuyama H,Mattarollo SR,et al.Clinical evaluation of autologous gamma delta T cell-basedimmunotherapy for metastatic solid tumours[J].British J Cancer,2011,6(105):778-786.

[6] Ministry of Health of the People's Republic of China.原发性肝癌诊疗规范(2011年版)[J].临床肝胆病杂志,2011,27(11):22-40.

[7] DuPage M,Mazumdar C,Schmidt LM.Expression of tumour-specific antigens underlies cancer immunoediting[J].Nature,2012，482(7385):405-409.

[8] Kapp M,Rasche L,Einsele H,et al.Cellular therapy to control tumor progression.[J].CurrOpin Hemato1,2009,16(6):437-443.

[9] Li J,Herold MJ,Kimmel B,et al.Reduced expression of the mevalonate pathway enzyme farnesyl pyrophosphate synthase unveils recognition of tumor cells by Vgamma9Vdelta2 T cells[J].J Immunol,2009,182(12):8118-8124.

[10] Kunz mann V,Kimmel B,Herrmann T,et al.Inhibition of phosphoantigenmediated gammadelta T-cell proliferation by CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells[J].Immunology,2009,126(2):256-267.

Objective To pride the difference of percentage, mature classifi cation of Vγ9Vδ2T cell in peripheral blood between patients with HCC and healthy people, the index changes after amplifi cation in vitro. Methods 10 mL were taken from the peripheral blood of HCC patients (n= 20) and healthy donors (n=10), Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by the discontinuous density gradient centrifugation. The delta 2 T cells mature and differentiate subtypes of Vγ9Vδ2Tcells were detect by using flow cytometry, Vγ9Vδ2Tcell were selectively cultured with zoledronate and human IL - 2, after 12-14 days cells were collected and tested the above indicators again. Results The average percentage ofVγ9Vδ2Tcell of total T cell in peripheral blood of HCC patients is lower than healthy people in front of the train (P<0.05, P=0.009), after in vitro augmentation training with drugs the proportion increased signifi cantly (P<0.0001).While Vγ9Vδ2Tcell’s percentage of patients and healthy people have no difference after amplification in vitro (P>0.05, P=0.3408). When differentiation and mature subtypes of Patient’s Vγ9Vδ2Tcell were compared between before and after culturing in vitro, we can found that the proportion of Tn, Tcm,Temra before training were signifi cantly lower than after the training (P<0.05, P=0.0045, P=0.0236, P=0.0162); and proportion of Tem before training were higher than after the training (P<0.0001). While differentiation proportion of mature t cells of the patients and healthy people had no statistical difference comparing amplifi cation of before with after. Conclusion While the percentage of Vγ9Vδ2Tcell of HCC patients in peripheral blood was lower than healthy people, but its matured subtypes are similar to those of healthy people. After amplifi cation in vitro the ratio of Vγ9Vδ2Tcells and total effective cells have no difference with healthy people. Its Function of amplifi cation can also restore. When applying this method to amplify Vγ9Vδ2Tcells of peripheral blood in vitro its effect is similar in HCC patients and healthy people.

Hepatocellular carcinoma;Vγ9Vδ2T; Adoptive cellular immunotherapy; Zoledronate

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.7.001

山西省科技攻关项目（130313021-17） 国家自然青年科学基金（81201810） 广东省自然科学基金面上项目（2015A030313057)

山西 030032 山西医科大学附属山西大医院 （马俊） 山西医科大学附属山西大医院普外科 （赵浩亮 田伟 贺杰峰） 山西医科大学第二医院（李高鹏）

赵浩亮 E-mail:haoliangzhao@hotmail.com