CIBR处理模拟生活污水的效果及菌群分析

钟振兴，兰 雄，丁兴辉，陆谢娟，章北平

(1．华中科技大学环境科学与工程学院，湖北 武汉，430074;2．武汉市规划设计有限公司，湖北 武汉，430014;3．中信建筑设计研究总院有限公司，湖北 武汉，430014)



CIBR处理模拟生活污水的效果及菌群分析

钟振兴，兰 雄，丁兴辉，陆谢娟，章北平

(1．华中科技大学环境科学与工程学院，湖北 武汉，430074;2．武汉市规划设计有限公司，湖北 武汉，430014;3．中信建筑设计研究总院有限公司，湖北 武汉，430014)

污水处理；CIBR;模拟生活污水；高通量测序；活性污泥；菌群

生活污水是世界各地最主要的污水来源之一，而生物处理工艺是应用最广、最廉价的污水处理方式，该工艺的核心在于活性污泥中种类繁多的微生物。近年来，采用高通量测序等技术，国内外学者对城市污水处理厂中的活性污泥进行了较为广泛的研究，对微生物菌群的组成和结构有了较多的认识，但是这些研究的重点主要集中在A2/O、A/O和MBR等常规生物处理工艺上[1-3]。随着紧凑型一体化生物处理工艺的快速发展和应用，有必要对这类新型工艺中的微生物组成和结构、优势菌群、功能细菌等进行深入分析。

连续流一体化生物反应器(continuous-flow integrated biological reactor, CIBR)[4]是一种新型高效的一体化生物脱氮除磷工艺设备。本研究在实验室中采用CIBR处理模拟生活污水，考察CIBR的污水处理效率，为后续处理实际生活污水提供技术参考；同时，采用Illumina高通量测序对CIBR中微生物进行鉴定分析，以便深入了解CIBR中的微生物构成和分布、优势菌群、功能细菌以及各污染物可能的去除途径，为CIBR工艺优化管理和性能改善提供明确的指导和建议。

1 材料与方法

1.1 实验用水

将人工配水和食堂餐饮废水按1∶1比例混合后的模拟生活污水用作进水，以防止由于微量元素缺乏而导致污泥膨胀、性能不稳等问题。人工配水主要由自来水、葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾、碳酸氢钠及适当微量元素等配制。食堂餐饮废水取自武汉市华中科技大学东园学生食堂排水井，该废水和模拟生活污水的水质参数如表1所示。

表1 废水主要水质特征

1.2 实验装置

本实验采用的连续流一体化生物反应器结构如图1所示。CIBR采用有机玻璃制作，由进水箱(900 L)和生物系统(470 L)两部分组成，生物系统包括生物反应区(370 L)、三相分离区(单个10 L，两侧各一个)、沉淀区(单个40 L，两侧各一个)。通过时控开关调节，实现交替曝气和搅拌，形成好氧、缺氧环境达到脱氮除磷的功效。生物反应区和沉淀区通过三相分离区连通，同时，在三相分离区可以实现泥、水高效分离并自动返回至反应区，以保持系统污泥浓度稳定。

1—进水箱；2—进水管；3—进气管；4—空气流量计；5—蠕动泵；6—空气泵；7—排泥管；8—溢流堰；9—监测仪；10—搅拌桨；11—微孔曝气管；12—取样管；13—三相分离区；14—沉淀区；15—生物反应区

图1 CIBR结构示意图

Fig.1 Schematic diagram of CIBR

CIBR运行工况为曝气3 h，搅拌3 h，水力停留时间(HRT)为12 h，每天排泥25 L，控制污泥龄(SRT)约15 d，以确保反应器的除磷效果。接种污泥取自武汉市龙王嘴污水处理厂(简称“WWTP”)好氧池，该污水厂采用厌氧-缺氧-好氧(A2/O)工艺，主要处理城市生活污水。

1.3 菌种分析方法

1.3.1 样本 DNA 抽提和检测

在CIBR驯化完成并达到稳定后，分别从污水厂好氧池和CIBR中取活性污泥样品100 mL进行测序分析。样品微生物 DNA 的提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒(MOBIO公司，美国)，提取方法按照试剂盒说明书进行。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA总量和完整性，并用Qubit 3.0荧光定量仪检测DNA浓度。

1.3.2 细菌16S rDNA序列扩增和MiSeq测序

选取16S rDNA的V4～V5 区序列进行高通量测序分析。采用两步PCR扩增方法进行文库构建。将纯化的DNA作为模板，利用16S rDNAV4～V5区通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和926R(5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’)PCR扩增目的片段16S rDNA V4～V5区，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测效果较好的样本于2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收，以回收产物为模板进行一次8循环的 PCR 扩增，将 Illumina 平台测序所需要的接头、测序引物、标签序列添加到目的片段两端。全部 PCR 产物采用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司，美国)进行回收，并用 FTC-3000TM Real-Time PCR 仪进行荧光定量，均一化混匀后完成文库构建，在Illumina MiSeq 2 × 300 bp平台上完成测序。

第一次PCR反应体系：5×扩增缓冲液 10 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL, Phusion 超保真 DNA聚合酶1 U，正、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板DNA 20～50 ng，补充超纯水至 50μL。PCR反应条件为94 ℃×2 min；94 ℃×30 s, 56 ℃×30 s，72 ℃×30 s，72 ℃×5 min，25个循环。

第二次PCR反应体系：5×扩增缓冲液8 μL，dNTP (10 mmol/L)1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶 0.8 U，正、反向引物(10 mmol/L)各1 μL，模板DNA 5 μL，补充超纯水至40 μL。PCR反应条件为 94 ℃×2 min；94 ℃×30 s, 56 ℃×30 s，72 ℃×30 s，72 ℃×5 min，10 ℃保温，8个循环。

1.3.3 数据分析

对原始数据通过barcode分配样品reads，得到样本的有效序列，根据PE reads之间的重叠关系，采用mothur(1.33.2)软件将成对reads拼接成一条序列，并对序列质量进行筛选和过滤，将模糊碱基、过长和过短的序列以及PCR过程中产生的嵌合体去除，得到优化序列，再进行OTU(operational taxonomic unit)聚类和物种信息注释。将相似性不低于97%的序列归为同一分类单元OTU，利用mother (1.33.2)进行一系列群落结构等统计学分析。

1.4 废水检测方法

废水中常规指标检测方法为：氨氮采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535—2009)；硝态氮采用麝香草酚分光光度法(GB/T 5750.5—2006)；亚硝态氮采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB/T 7493—87)；COD采用微波消解法；TN采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法(HJ 636—2012)；TP 采用钼酸铵分光光度法(GB/T 11893—1989)。温度和溶解氧(DO)采用WTW溶氧仪(WTW-3410)测定，配备有FDO-925型探头(WTW公司，德国)，pH值采用赛多利斯PB-10型pH计测定(Sartorius公司，德国)。

2 结果与讨论

2.1 CIBR对模拟生活污水中污染物的去除效果

(a)COD

-N

(c) TP

Fig.2 Removal efficiency of pollutants in the simulated domestic wastewater by CIBR

2.2 CIBR中微生物菌群多样性分析

为揭示CIBR中污染物可能的去除途径，优化运行工况，提高生物系统性能，采用Illumina高通量测序对取自WWTP的接种污泥以及稳定运行期间CIBR污泥中的微生物菌群进行多样性分析，其结果见表2。

表2 活性污泥中菌群多样性指数(相似度为97%)

由表2可见，在97%相似水平上，根据Chao和Ace丰富度指数可知WWTP样品的物种丰富度明显高于CIBR样品，而Shannon和Simpson指数也表明CIBR样品的生物多样性明显低于WWTP样品。上述结果可能主要与两个生物系统采用不同的处理工艺以及进水水质不同有关。WWTP采用厌氧-缺氧-好氧(A2/O)工艺处理城市生活污水，其运行工况、微生物生长环境和进水水质都相对复杂，而CIBR采用一体化的缺氧/好氧工艺，运行工况、微生物生长环境和进水组分相对简单[10-12]。已有研究人员[1-2, 13-14]利用方差分解证实，处理工艺和进水水质是影响微生物丰富度和多样性的最主要因素。另外，两个样品的coverage指数均达到99.8%，表明测序结果能很好地反映样品的真实情况。

2.3 CIBR中菌群结构分析

在门、目和属3个分类水平上对测序结果进行归类，分析两个污泥样品在不同分类水平上的菌群组成及相对丰度，其结果如图3～图5所示。

由图3可见，在门级别，WWTP样品生物系统中Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度分别达到63.6%和23.8%(合计87.4%)，CIBR样品对应值为71.5%和21.3%(合计92.8%)，二者在污泥菌群中是绝对的优势物种，这与其他研究人员的报道基本一致。文献[1-2]中指出，Proteobacteria和Bacteroidetes是大多数城市污水处理厂活性污泥中的优势菌群，Proteobacteria还是参与降解有机物和芳香族化合物、去除氮磷的最主要菌种。从图3中还可知，两个样品中其余菌群的丰度均低于2%，且分布存在一定相似性。这一方面可能是因为CIBR菌种是从WWTP曝气池接种而来，另一方面可能是因为CIBR的进水是模拟生活污水，与城市生活污水存在一定的相似性。

图3 两个样品在门级别上的菌群结构对比

Fig.3 Comparison of microbial community structures of two samples at the phylum level

在目级别(见图4)，Burkholderiales、Sphingobacteriales和Rhodocyclales是WWTP样品中最主要的菌种，相对丰度均达15.7%～17.2%，Xanthomonadales、Sphingomonadales、Nitrospir-ales和Myxococcales的相对丰度为4.4%～5.3%，这七种菌群是WWTP接种污泥中的优势菌种，且分布相对较为均匀。Rhodocyclales (相对丰度为41.8%)是CIBR样品中最主要的优势菌种，相比接种污泥其丰度明显增加，这可能是因为该菌种能很好地适应CIBR好氧/缺氧交替运行的特点。CIBR样品中Burkholderiales和Sphingobacteriales的相对丰度基本不变，分别为15.7%和17.2%，表明二者对CIBR反应器有较好的适应能力。

图4 两个样品在目级别上的菌群结构对比

Fig.4 Comparison of microbial community structures of two samples at the order level

在属水平(见图5)，Ferribacterium和Prevotella均为WWTP和CIBR样品中的优势厌氧菌，Ferruginibacter、Haliangium和Novosphin-gobium是WWTP样品中的优势好氧菌。上述

(a) WWTP样品

(b) CIBR样品

厌氧菌和好氧菌是WWTP厌氧池和好氧池中降解有机物的主要贡献者[15]。CIBR样品中好氧菌丰度为11.2%，低于WWTP污泥好氧菌丰度19.4%。Haliangium(相对丰度1.7%)和Ferruginibacter(相对丰度3.0%)是CIBR样品中的优势好氧菌，在CIBR曝气阶段，两者均能分解利用有机物。两个生物系统中兼性菌的丰度分别为4.3%和20.3%，主要差异来自Zoogloea。Zoogloea是典型的兼性菌，在好氧条件下分解有机物，在缺氧或厌氧条件下利用有机物，同时参与反硝化作用除硝氮[16]。CIBR样品中Zoogloea丰度明显增加，可能是因为该菌属能较好适应CIBR中好氧/缺氧交替运行的环境。

两种污泥中氨氧化菌(AOB)(Nitrosomonas)和亚硝氮氧化菌(NOB)(CandidatusNitrotoga和Nitrospira)种类完全一致，但相对丰度差异较大，WWTP样品中AOB和NOB相对丰度分别为2.7%和2.4%，而CIBR样品对应值仅为0.5%和0.7%。这可能与WWTP采用A2/O工艺有关，该工艺中厌氧池、缺氧池和好氧池相对独立，各自控制不同的溶氧，有利于专属菌种的适应和生长。尽管CIBR样品中AOB和NOB相对丰度较低，但并不影响该反应器高效的硝化作用。Ma等[17]发现，在活性污泥中AOB和NOB丰度仅为0.01%～1%的条件下，所调查的9个焦化废水生物处理厂均能实现废水中氨氮的高效去除，类似结果也被其他研究所证实[18]。

CIBR样品中反硝化菌相对丰度为12.2%，略低于WWTP样品对应值(14.1%)。Dechloromonas和Thermomonas是两个生物系统中最主要的反硝化菌，相对丰度分别达6.8%～9.1%和1.0%～3.0%。CIBR样品中其他反硝化菌的种类明显少于WWTP样品，可能是因为WWTP进水有机物种类相对复杂并且有独立的缺氧池，有利于异养反硝化菌的多样性生长和代谢[19]。此外，CIBR能达到较好的TP去除效果，可能与聚磷菌(PAOs)有关。Gemmatimonas是WWTP样品中主要的聚磷菌(相对丰度0.7%)，而CIBR样品中的主要聚磷菌为CandidatusAccumulibacter(相对丰度0.7%)，不同种类的聚磷菌可能与两个系统的工况差异和进水磷形态差异有关，这有待于进一步的研究证实。

3 结论

(2)高通量测序发现，在门级别，Proteobacteria和Bacteroidetes是WWTP接种污泥和驯化完后CIBR活性污泥中最主要的菌群。在属水平上，两个生物系统中好氧菌、兼性菌、反硝化菌、AOB、NOB以及聚磷菌(PAOs)的种类和丰度均存在明显差异，这可能与运行工况和进水水质不同有关。

(3) 通过分析两个生物系统的菌群差异，不仅可以揭示CIBR高效去除有机物和氮磷的途径，还可在一定程度上解释两个系统中含碳氮磷等污染物的去除率和去除途径差异。

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[责任编辑 尚 晶]

Performance and bacterial community analysis of continuous-inflow integrated biological reactor treating simulated domestic wastewater

ZhongZhenxing1,LanXiong2,DingXinghui3,LuXiejuan1,ZhangBeiping1

(1.School of Environmental Science and Engineering, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430074, China; 2. Wuhan Planning and Design Company, Wuhan 430014, China;3. CITIC General Institute of Architectural Design and Research Co., Ltd., Wuhan 430014, China)

wastewater treatment; CIBR; simulated domestic wastewater; high-throughput sequencing; activated sludge; bacterial community

2016-09-06

国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2012AA06A304); 国家科技支撑计划资助项目(2012BAC05B02).

钟振兴(1985-)，男，华中科技大学博士生. E-mail: xing2006z@163.com

章北平(1956-)，男，华中科技大学教授，博士生导师. E-mail: probpzhang@126.com

X703.1

A

1674-3644(2016)06-0439-07