淫羊藿苷对SGC-7901细胞内CaSR及Survivin、Runx3基因表达的影响

李　姝　许晓义　孙　健　董　琦　陈　彻



淫羊藿苷对SGC-7901细胞内CaSR及Survivin、Runx3基因表达的影响

李姝1，2许晓义2孙健2董琦2陈彻1

【摘要】目的 观察淫羊藿苷（ICA）联合钙敏感受体（CaSR）活性改变对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，及其细胞内CaSR及Survivin、Runx3基因表达的影响。方法 MTT法与Hoechst染色法测定细胞的增殖与凋亡情况。Western blot和RT-PCR技术检测CaSR、Survivin及Runx3蛋白和mRNA的表达情况。结果 ICA联合Calindol（CaSR激动剂）抑制SGC-7901细胞增殖，细胞生长抑制率与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0．05），呈时间依赖性；并诱导细胞凋亡。ICA联合Calindol促进SGC-7901细胞内CaSR和Runx3蛋白和mRNA表达上调，Survivin蛋白和mRNA表达下调。结论 ICA联合Calindol能够抑制胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导凋亡，其作用与下调Survivin和上调Runx3的表达有关。

【关键词】淫羊藿苷；胃癌SGC-7901细胞；CaSR；Runx3；Survivin

作者单位：1 甘肃中医药大学医学技术学院生化教研室，甘肃 兰州730000；2 牡丹江医学院基础医学院机能学教研室，黑龙江 牡丹江157011

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，根据2012年［1］中国肿瘤登记年报，胃癌在我国发病率高居第二位，死亡率也高居第三位。中医认为胃癌［2］的形成与内外因关系密切，正气不足贯穿于胃癌发病的始终。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿的主要有效提取成分，现代药理学研究证明ICA具有扶正培本，活血化瘀，增强免疫力且不良反应小、对染色体无改变和不产生基因突变的特点，对多种肿瘤细胞例如肺癌、肝癌、淋巴瘤［3］等具有增殖抑制的作用。

1　材料与方法

1.1细胞

SGC-7901细胞，购自中国科学院上海细胞库。

1.2实验药品及试剂

ICA（成都瑞芬思生物科技有限公司）；改良型RPMI1640培养基（Hyclone公司）；Calindol、Calhex231（美国Sigma）；全蛋白提取试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 人胃癌细胞株SGC-7901用含10％胎牛血清的改良RPMI1640培养液（含1％双抗），置于37℃，5％CO2培养箱中培养，实验所用细胞均处于对数生长期。

1.3.2MTT法检测细胞增殖 实验设对照组、实验组、阳性对照组，以1×105/ml的悬液接种于96孔板中。每组设3个复孔，重复3次，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 ul，4 h后，弃上清，加入DMSO溶液150 ul，振荡10 min，用酶标仪于490 nm波长下测定每孔A值，取平均值，按细胞生长抑制率=（1-实验组A平均值∕对照组A平均值）×100％计算。

1.3.3Hoechst染色检测细胞凋亡 将清洁盖玻片置于6孔板内，种板，孵育24 h，分组加药后继续培养48 h。加入4％多聚甲醛0.5 ml，固定20 min。加入1 ml Hoechst33342染色液，室温染色15～30 min。吸除染色液，PBS洗涤2次，每次3 min。

1.3.4Western blot技术检测CaSR、Survivin及Runx3 收集各组细胞，提取细胞总蛋白。BCA法测蛋白浓度后，取40μg蛋白上样，电泳，转膜，封闭，一抗anti-CaSR（1﹕1000）、anti- Survivin（1﹕500）、anti- Runx3（1﹕500）4℃过夜，洗膜后，常温二抗孵育1 h，ECL发光试剂盒显色后曝光、显影、定影、扫描。

1.3.5RT-PCR技术检测CaSR、Survivin及Runx3 按高纯总RNA快速提取试剂盒（中国 BioTeke）提取总RNA，反转录，实时荧光定量分析，使用MX-3000P软件（美国Stratagen公司）分析PCR过程各检测样本的CT（Threshold cycle）值。

1.4统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析处理，实验结果以（均数±标准差）（±s）表示，单因素方差分析（One-Way，ANOVA）进行组间差异的比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1ICA联合CaSR活性改变对SGC-7901细胞增殖的影响

ICA联合Calindol作用于SGC-7901细胞后，联合用药组的细胞生长抑制率均高于二者单独作用效果，具有时间依赖效应（见表1）。

2.2ICA联合Calindol对SGC-7901细胞凋亡的影响

Hoechst染色结果显示，与对照组相比，ICA联合Calindol作用于SGC-7901细胞后，凋亡细胞的细胞核变小，呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染的颗粒状荧光（图1）。

图1　ICA联合Calindol对SGC-7901细胞凋亡的影响A．对照组；B．ICA（200 mg/L）；C．ICA（200 mg/L）+ Calindol（10 μg/L）；D．卡铂（1 mg/ml）

2.3Western blot和RT-PCR检测CaSR、Survivin、Runx3蛋白和mRNA表达

结果显示，ICA促进Runx3蛋白和mRNA表达上调，抑制Survivin蛋白和mRNA的表达，与对照组相比P＜0.05。ICA与Calindol联合后CaSR、Runx3蛋白和mRNA表达上调，Survivin蛋白和mRNA表达下调的水平均大于二者单独作用效果，差异具有统计学意义，P＜0.05（见图2）。

图2　ICA联合CaSR活性改变对SGC-7901细胞内CaSR、Survivin、Runx3蛋白及mRNA表达的影响注：1．对照组；2．ICA（200 mg/L）；3．Calindol（10ug/L）；4．Calhex231（10ug/L）；5．ICA（200 mg/L）+ Calindol（10ug/L）；6．ICA（200 mg/L）+ Calhex231（10ug/L）；7．阳性对照组：卡铂（1mg/mL）

3　讨论

近年来，淫羊藿苷的抗肿瘤作用越来越受到医药研究者的重视。研究内容所涉及的抗肿瘤途径不尽相同，对于具体癌症细胞的作用机制也不尽相同。Ca2+是细胞信号转导中的第二信使，研究发现Ca2+可以通过CaSR发挥“第一信使”的作用，调节细胞的增殖、分化、凋亡和分泌［4］。细胞凋亡是生理性细胞死亡的过程，有助于正常细胞和组织的生长和维护。细胞凋亡通路的失调会导致一些疾病如恶性肿瘤的发生，所以直接调控凋亡的Survivin蛋白在肿瘤发生发展中发挥越来越重要的作用［5-8］。抑癌基因Runx3是转录因子Runt结构域家族的一员，并在细胞凋亡、血管再生、上皮间质转化、细胞迁移和侵袭的调控上起关键作用。目前尚未有关于ICA联合CaSR活性改变对胃癌细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用与Survivin、Runx3基因的表达变化情况的相关报道。本实验采用Western blot 和RT-PCR技术检测ICA联合Calindol对SGC-7901细胞内CaSR、Survivin、Runx3表达的影响，结果显示ICA促进CaSR表达上调，但没有统计学意义；促进Runx3蛋白表达上调和Survivin蛋白表达下调，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。

表1　ICA联合CaSR活性改变对SGC-7901细胞的抑制率（n=3，±s）

表1　ICA联合CaSR活性改变对SGC-7901细胞的抑制率（n=3，±s）

注：1．对照组；2．ICA（200 mg/L）；3．Calindol（10ug/L）；4．Calhex231（10ug/L）；5．ICA（200 mg/L）+ Calindol（10ug/L）；6．ICA（200 mg/L）+ Calhex231（10ug/L）；7．阳性对照组：卡铂（1mg/mL）；与对照组比较，*P＜0.05

24h　48h　72h A值　抑制率（％）　A值　抑制率（％）　A值　抑制率（％）1　1.136±0.040　—　1.286±0.037　—　1.431±0.064　—2　0.669±0.002　41.094±2.082*　0.572±0.123　55.495±2.167*　0.482±0.024　66.255±2.615* 3　0.869±0.043　24.594±6.345*　0.772±0.025　39.905±3.110*　0.671±0.019　53.014±3.224* 4　1.171±0.087　-3.024±4.439　1.477±0.061　-15.003±7.635*　1.722±0.278　-19.948±13.985* 5　0.535±0.023　52.832±3.493*　0.490±0.029　61.850±3.155*　0.395±0.015　72.323±2.044* 6　0.872±0.036　21.949±2.563*　0.816±0.013　36.462±2.411*　0.754±0.013　47.200±2.900* 7　0.436±0.015　61.551±1.997*　0.235±0.006　81.732±0.860*　0.204±0.002　85.713±0.752*分组

综上所述，ICA联合Calindol对SGC-7901细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，这与其促进Runx3基因表达上调和Survivin基因表达下调有关。然而，ICA作为淫羊藿的主要有效单体成分，其抑制增殖、诱导凋亡的作用可否应用于临床胃癌患者的中药复方制剂，还有待于进一步研究。

参考文献

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The Effect of Icariin on the Expression of CaSR， Survivion， Runx Gene in SGC-7901 Cells o

LI Shu1，2 XU Xiaoyi2 SUN Jian2 DONG Qi2 CHEN Che1， 1 Department of Biochemistry， College of medical technology， Gansu University of traditional Chinese medicine， Lanzhou Gansu， 730000， China， 2 Department of function， College of Basic Medicine， Mudanjiang Medical University， Mudanjiang Heilongjiang， 157011， China

［Abstract］Objective To observe the effect of activity changes of icariin combined with calcium sensing receptor （CaSR） on the proliferation and the expression of CaSR， Survivin and Runx3 genes in SGC-7901 cell. Methods The method of MTT and Hoechst staining d were used to detect the proliferation and apoptosis of cells. The technology of western blot and RT-PCR were used to detect the expression of CaSR， Survivin，Runx3 protein and mRNA. Results ICA combined with Calindol （CaSR agonist） inhibits the proliferation of SGC-7901 cells， which showed a time dependent manner and induced cell apoptosis， compared with the control group， the difference was statistically significant （P＞0.05）. ICA combined with Calindol promotes the expression of CaSR， Runx3 protein and mRNA in SGC-7901 cells. Conclusion ICA combined with Calindol can inhibit the proliferation and induce apoptosis of SGC-7901 cells， its effect is related to the expression of Survivin down-regulation and Runx3 up-regulation.

［Key words］ICA， Gastric cancer SGC-7901 cells， CaSR， Runx3， Survivin

【中图分类号】R735

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9308（2016）11-0227-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．11．155

项目基金：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（项目编号：12531749）

通讯作者：陈彻，E-mail：chen72123@163．com