羊肚菌物种多样性研究现状

王　龙，郭　瑞，路等学，秦　鹏，赵玉卉

(甘肃省科学院 生物研究所，甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃省工业微生物工程技术研究中心，兰州　730000)



羊肚菌物种多样性研究现状

王龙，郭瑞，路等学，秦鹏，赵玉卉

(甘肃省科学院 生物研究所，甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃省工业微生物工程技术研究中心，兰州730000)

摘要羊肚菌Morchella spp.是一类珍稀食药用真菌，具有重要的经济和科研价值。对羊肚菌的传统分类研究、生态位特征、生活史、生活习性及其分子生物学等方面的研究成果进行综述，总结现阶段羊肚菌研究取得的主要成绩；此外，简述甘肃甘南藏族自治州有关野生羊肚菌资源的研究现状，分析目前当地野生羊肚菌资源研究中存在的问题，并指出解决这些问题的相应思路，为甘肃甘南藏族自治州野生羊肚菌的可持续开发利用提供参考。

关键词羊肚菌；物种多样性；分子生物学；甘肃省；综述

羊肚菌Morchellaspp.俗称羊雀菌、羊肚菜或草笠竹，隶属子囊菌亚门Ascomycotina，盘菌纲Discomycetes，盘菌目Pezizales，羊肚菌科Morchellacea，羊肚菌属Morchella，因其菌盖表面具有棱脊型的网状体，外观极似羊肚而得名[1]。羊肚菌富含各类氨基酸和维生素，又因其肉质脆嫩，风味独特，一直被奉为宴席上的美味佳肴，在国内外是食(药)用真菌的珍品之一。该菌最早收录于李时珍的《本草纲目》，蘑菇蕈条下记载“一种状如羊肚，有蜂巢眼者，名羊肚菌”。中医认为其具有理气化痰、壮阳补肾、提神醒脑的功效；而西医认为此菌可降血脂，调节免疫力，具有抗疲劳、抗辐射和抗肿瘤的作用[2-3]。自1897年Boudier首次建立羊肚菌属以来，菌物学家们针对羊肚菌的分类、分布、生态、菌种保育及栽培技术等开展大量研究工作。20世纪初，主要探讨该菌种属的问题；20世纪50年代，基本掌握羊肚菌营养要求等生理特性；60年代中期，美、法等国成功进行羊肚菌深层发酵培养，并发展为大规模菌丝发酵工业化生产；80年代初，美国首次报道室内人工栽培羊肚菌成功；90年代初，美国报道了羊肚菌生活史的全面运行图，为羊肚菌生物学特性的研究，及进一步深入研究羊肚菌生活史提供必要参考[4]。近百年来，在全世界范围内对羊肚菌资源保育及其开发利用研究依然是国内外学者探讨的重要课题之一。

1羊肚菌传统分类学研究

传统的羊肚菌分类学研究主要基于羊肚菌的生态学和形态学特征，包括子实体形态观察以及子囊、孢子，菌核和侧丝的显微观察等。经过长期研究，菌物学家们对羊肚菌的基本形态有一定的了解和认识，这对今后羊肚菌分类系统学研究奠定理论基础。羊肚菌科中属级分类不存在争议，羊肚菌科包括羊肚菌属Morchella，钟菌属Verpa和皱盘菌属Disciotis，但羊肚菌属内种间分类一直存在较大争议，种的划分较混乱。Emile[5]汇总以往的研究资料，在《Les Morilles》一书中将收集到的羊肚菌划分为28个分类单元，认为其广泛分布于北半球的德国、法国、中国和美国等地。Kirk等[6]也采用Emile的观点，将羊肚菌划分为28个种。根据Boudier的分类系统，羊肚菌属可以分为4个组(真生组、开裂组、假直生组和纸质生组)和2个亚组(羊肉质亚组和肉质亚组)[7]。Hallen等[8]根据形态学分类，将其划分为100种以上。在中国，戴芳澜[9]将前人报道的中国真菌资料进行汇总和整理，编著《中国真菌总汇》一书，其中记载中国羊肚菌有8个种，分别为尖顶羊肚菌Morchellaconica、高羊肚菌Morchellaelata、小顶羊肚菌Morchellaangusticeps、开裂羊肚菌Morchelladistans、粗柄羊肚菌Morchellacrassipes、羊肚菌Morchellaesculenta、小羊肚菌Morchelladeliciosa和硬羊肚菌Morchellarigida。

虽然羊肚菌的分类系统学研究历史悠久，但其分类体系仍存在较大争议。因为不同学者的研究重点和分类依据有差异，势必会建立不同的分类系统，当前羊肚菌种的划分从3个种到32个种不等；针对这种复杂的分类情况，有学者提出多态物种(Polymorphic Species)的概念，将已研究报道的羊肚菌分为3个多态种，分别为黄羊肚菌(Yellow morels)、黑羊肚菌(Black morels)和开裂羊肚菌(Semifree capped morel)，其中，黄羊肚菌包括M.esculenta、M.deliciosa和M.crasspies，黑羊肚菌包括M.ealat、M.angusticeps和M.conica，开裂羊肚菌包括M.semilibera[10-12]。此外，Gaston等[13]还提出第4个组别，即红色羊肚菌(Blushing morels)，该组包括危地马拉羊肚菌M.guatemalensis和红褐羊肚菌M.rufobrunnea，这2个种仅分布在热带和亚热带地区；同时还提出羊肚菌分类的几个重要依据：子囊果的颜色和形状、脊的位置、囊状体长、染色反应以及子囊、子囊孢子、侧丝特征。

据现有研究资料统计，中国目前报道的羊肚菌约有15种，这些种类主要分布在西南地区的云南省、四川省及西北地区的甘肃省、宁夏回族自治区、新疆维吾尔自治区等[14-22]。中国羊肚菌的种类与分布情况见表1。

表1　中国羊肚菌的种类及分布地区

目前，已针对羊肚菌传统分类系统学开展大量研究工作，然而，由于菌物学家们建立的分类依据依然存在较大争议，还要研究者进一步寻求更可靠和更简便的研究方法，为羊肚菌的分类鉴定工作提供新的和可信的数据。

2羊肚菌生态位特征

羊肚菌Morchellaspp.主要分布在北半球温带、寒温带地区，主要出现在冬季寒冷、常有降雪的区域；南半球发生较少，主要集中在智利、阿根廷等南美国家；此外，亚热带及地中海区域有少量分布。羊肚菌发生区域生态环境复杂多样，而且不同种类也有生态上的分化。

2.1发生时间

根据现有文献统计，大部分学者普遍认为羊肚菌在每年的春末夏初和秋季雨后常时有发生。任桂梅等[23]总结报道，大兴安岭的羊肚菌发生在5月末至7月初，6月中旬至7月为最适生长期。李峻志等[24]调查研究秦岭山区羊肚菌时发现，该地区4月中下旬到5月上旬是野生羊肚菌的多发期。胡伟等[25]调查统计显示，黑龙江省野生羊肚菌的发生时间一般在5月中旬至月末，全年其他时间未见生长。姜淑霞等[26]统计泰山周围的野生羊肚菌时发现，该地区羊肚菌发生期主要在春末夏初，通常发生在每年的5-6月。申进文等[27]调查河南省栾川县羊肚菌时得知，该地区羊肚菌盛产期为4月中旬。李毅等[28]调查山西省羊肚菌时发现，该省的5种野生羊肚菌多发于每年的4月下旬至5月中旬。申时才等[29]调查云南香格里拉野生羊肚菌资源时发现，该地区尖顶羊肚菌M.conica的盛产期一般在每年的5月下旬到6月中旬。羊肚菌属于低温高湿性真菌，当平均气温高于8 ℃，地温为0～2℃时便有大量菌丝萌发，此时为萌动期；当气温达15～18℃，地温为6～9 ℃时，菌丝生长迅速并进行组织分化，形成子实体原基，随温度升高，羊肚菌破土而出并迅速生长，此时为盛产期；当气温超过23 ℃，地温高于12 ℃时，子实体生长缓慢，进入消失期。羊肚菌生长的最适温度为6～11 ℃，相对湿度为65%～78%(盛产期要求达到78%)。羊肚菌生长期除需较低的气温外，还需较大的温差刺激菌丝体的分化，其中萌动期和盛产期的日较差要求大(3.3～22 ℃)，日较差大于10～15 ℃的时间需45～60 d；消失期的日较差要求小，日较差大于10～15 ℃的时间需11～20 d。综上可知，在中国不同地区、不同省份，因经纬度、海拔等的不同，势必造成各地区温度、湿度的明显差异，这些均会直接影响羊肚菌的发生时期。

2.2环境温度

羊肚菌属于低温型真菌，从全球范围来看，其主要分布于北半球的欧亚大陆和北美洲，羊肚菌的生长适宜温度因不同地域而异。Ower[30]研究认为，羊肚菌菌丝体在3～28 ℃均能生长，最适温度为15～18 ℃，低于3 ℃或高于28 ℃时其菌丝体生长停止或死亡；孢子散发适宜温度15～18 ℃，孢子萌发适宜温度18～22 ℃，子实体在10～18 ℃均能生长，最适温度12～16 ℃。黄国学等[31]调查辽宁省野生羊肚菌发生期时发现，平均温度为12.9 ℃时羊肚菌普遍发生，而且盛产期昼夜温差较大。任桂梅等[4]研究四川和陕西2省野生羊肚菌时发现，平均气温大于15 ℃时羊肚菌子实体停止生长甚至消失。王文房等[32]调查临沂市郊羊肚菌时发现，当昼夜温差在10～15℃时有利于其子实体的生成。Winder[33]报道尖顶羊肚菌M.conicaDE10、DE11在低于8 ℃仍可以有效生长，这可能与土壤微生物因素有关，但菌丝生长的最佳温度为16～24 ℃。陈易飞等[34]研究苏州市郊羊肚菌时发现，羊肚菌菌丝在2～26 ℃均能生长，超过34 ℃时，菌丝停止生长，甚至死亡。谢占玲等[7]研究发现，羊肚菌菌丝体可在0～1 ℃的冰箱中生长，说明羊肚菌菌丝体的生长温度可低于3 ℃。熊春菊等[35]对云南玉龙县尖顶羊肚菌M.conica的菌丝体培养时发现，菌丝在25 ℃时日均生长速度最快。柴林山等[36]对辽宁朝阳河林区内的一株野生羊肚菌研究时发现， 25 ℃时菌丝长速达到最高值，为7.18 mm/d。 谢放等[37]在实验室内研究发现，变温条件不利于羊肚菌菌核的形成和菌丝生长；20 ℃时，羊肚菌菌落干质量和菌丝生长速度均达到最大值。

2.3环境湿度

羊肚菌的发生与发生区的降雨量密切相关，在降雨量较多且土壤容易保湿的环境中羊肚菌发生较为普遍。据有关资料显示，土壤相对湿度在50%～60%时，有益于羊肚菌子实体原基形成，土壤相对湿度在75%～95%时，则有益于羊肚菌子实体的发育[38]。Goldway等[39]首次报道以色列尖顶羊肚菌M.conica的发生可从当年开春的3月一直持续到深秋的10月。Obst等[40]研究报道美国西北部地区黑羊肚菌(Black morel)、黄羊肚菌(Yellow morel)和灰羊肚菌(Gray morel)的生长习性，他们认为，黄羊肚菌和灰羊肚菌多发于高海拔、较干燥的环境；而黑羊肚菌多发在海拔较低、湿度较大的环境。Mihail等[41]研究美国密苏里州野生羊肚菌发生地域的非生物因素时发现，当地羊肚菌的产生与发生地域环境的空气湿度呈正相关，若在盛产期前一个月有大于30 mm的降雨量，其发生概率明显增高。 杜习慧等[42]在较为系统地研究中国羊肚菌生物地理环境时发现，在中国羊肚菌发生最多的地方是温带针阔叶混交林地域，可能是因为这种复杂的生物地理环境可满足羊肚菌发生时所需的温度和湿度等条件。

2.4植被与土壤

据相关资料记载，野生羊肚菌多发生在北半球的针阔叶混交林的腐殖质层。顾龙云[43]在甘肃甘南藏族自治州境内野生羊肚菌的调查中发现，5种羊肚菌有时也发生在单一的针叶林内。刘都才等[44]在湖南考察后则认为，野生羊肚菌没有明显的伴生植物。赵永昌等[45]报道称，羊肚菌发生区植被类型大致可以分为4种，分别为果园(尤其旧苹果园)、草甸、火烧林地和针阔混交林。谈峰等[14]在江苏考察羊肚菌时发现，羊肚菌的发生常伴有泡桐树的存在，并以此来考虑泡桐树是否可作为当地羊肚菌发生的指示植物。

羊肚菌是一种土生菌，菌丝分布于土壤，从野外观察结果分析，羊肚菌发生与土壤类型有密切关系。经调查发现，羊肚菌多发生的土壤类型有黑壤土、山地灰褐森林土、沙壤土和黄壤土等。侯振彪等[46]研究发现，羊肚菌在被火烧过的松、桦等树桩旁也有发生，而且火烧次年是发生的高峰期，进入第3年则明显减少或基本不发生。说明，羊肚菌除在常见的土壤类型中生长外，还能在短时间内耐受高温并吸取火烧后土壤中可能留下的特殊营养源。

2.5根际微生物

张宗舟[47]对黑脉羊肚菌M.angusticepsPeek.，羊肚菌M.esculenta(L.) Pers.和尖顶羊肚菌M.conicaPers.的根际和根外微生物进行研究，结果显示，3种羊肚菌根外的微生物数量明显高于根际，根际放线菌的数量(4 700个)明显高于根外(3 700个)，羊肚菌根际细菌数量明显低于一般土样。赵永昌等[45]调查研究时发现，羊肚菌发生区的微生物环境与张宗舟[47]的研究结果极为相似，细菌、放线菌数量较多，而酵母菌差别较大。同时，在实验室内对收集到的117株羊肚菌分离时发现，菌丝体很容易被降解木质素和纤维素的真菌污染，可能是因为这些杂菌具有协同降解纤维素和木质素的作用，以利于日后羊肚菌子实体的形成。

2.6酸碱度

羊肚菌适宜生长在中性或微碱性的环境，pH略高于一般真菌，通常为6.5～7.9，若pH低于4.5或高于9，菌丝则停止生长或死亡。Robbins等[48]研究粗腿羊肚菌M.crasspies(Vent.) Pers.时发现，pH为7.7的富含Ca2+的培养基最适于羊肚菌菌丝生长。林杰[49]测定黑脉羊肚菌M.angusticepsPeek.的pH生长曲线时发现，羊肚菌pH生长曲线为锅齿形的双峰曲线，二峰值分别为7.0、8.4及7.3、8.3。车进等[50]研究陕西地区采集到的野生羊肚菌得知，酸碱度对羊肚菌菌丝体长势影响较大，pH为7.0左右时，菌丝日均生长速度达到最大。综合以上分析可知，羊肚菌生长的最佳pH与各地区的自然环境、微量元素等多种因素有关。

2.7光照和空气

据有关文献报道，在黑暗或微光条件下羊肚菌菌丝体生长较快，而在强光条件下对其子实体的生长发育可起到一定的促进作用[51-53]。董爱荣等[54]研究发现，小羊肚菌M.deliciosaFr.在原基形成及子实体发育时需要的照度为200～800 lx；同时，子实体的色泽在某种程度上易受散射光强弱的影响。董雪[55]研究黑脉羊肚菌M.angusticepsPeek.在4种光照条件下(黑暗、弱光、散射光和强光)的菌丝生长情况发现，各条件下试验菌株均能较好生长，但黑暗条件下菌丝体长势最好，强光则抑制菌丝体的生长。赵琪等[56]研究显示，尖顶羊肚菌M.conicaPers.在腐殖质土PDA培养基中菌丝生长阶段不需光照，但子囊果原基形成时需要600～1 000 lx的散射光。

羊肚菌也是好氧真菌，足够的氧气和良好的通风场所是保证羊肚菌正常生长发育的必要条件。菌丝生长阶段对空气没有明显要求，在子囊果形成和生长发育阶段对空气十分敏感，CO2体积分数超过0.3%时，子囊果瘦小、畸形，甚至腐烂。

2.8营养元素

菌物学家们普遍认为，羊肚菌Morchellaspp.可以在大多数真菌培养基上生长发育，但不同培养基因所含营养成分的不同势必造成羊肚菌菌丝生长速度及长势的差异。因此，探索羊肚菌菌丝体对碳、氮源及其他营养元素的利用仍十分重要。

2.8.1碳、氮源尤国信等[57]研究认为，羊肚菌M.esculenta利用的最佳碳、氮源分别是蔗糖和硝酸钾。杨绍彬等[58]试验发现，羊肚菌M.esculenta菌丝生长对培养基质中氮源含量的需求比较高，培养基质中的m(C)∶m(N)<20∶1。肖锋等[59]研究认为，羊肚菌M.esculenta最优的碳、氮组合应是蔗糖-尿素[m(C)∶m(N)=18∶1]。董爱荣等[54]研究认为，羊肚菌M.esculenta的最佳碳源是蔗糖，较好的氮源是尿素。赵春燕等[60]报道羊肚菌M.esculenta在以葡萄糖为碳源、硝酸铵为氮源的培养基上生长最好。陈芝兰等[61]研究发现，黑脉羊肚菌M.angusticeps的最适碳、氮源分别为蔗糖和尿素，并且无机氮源不利于羊肚菌菌丝体的生长发育，菌丝在复合腐质土PDA培养基上的长势最好。高成华等[62]研究发现，羊肚菌M.esculenta在固、液2种培养基上均能有效生长，但固体PDA培养基为最佳培养基。Winder[33]研究羊肚菌M.esculenta的生长特点时发现，甘露糖和蔗糖均为最佳碳源，在以麦芽糖和乳糖为碳源的培养基上，羊肚菌M.esculenta菌丝生长均非常缓慢，甚至停止，菌落形态差异较大。努尔古丽[63]研究新疆3种羊肚菌生长特性时得知，尖顶羊肚菌M.conica、黑脉羊肚菌M.angusticeps和羊肚菌M.esculenta对碳源、氮源的利用程度分别为：甘油<葡萄糖<蔗糖，硝酸铵<硫酸铵<硝酸钾，蛋白胨则是3种羊肚菌均不能利用的氮源。陶热等[64]研究九江地区小羊肚菌M.deliciosa时发现，羊肚菌菌丝体对碳源具有一定的选择性利用，单糖的利用程度明显要高于对二糖和多糖的利用程度；从氮源的利用程度来看，无机氮不利于小羊肚菌M.deliciosa菌丝的生长。由上述研究来看，多数学者认为葡萄糖和蔗糖可以作为适宜羊肚菌生长的碳源；硝酸钾、尿素和蛋白胨则为适宜羊肚菌生长的氮源，研究结果的差异可能与各学者采用的试验方法和研究对象不同有关，还有待进一步探讨。

2.8.2微量元素及维生素刁治民等[65]试验报道称，羊肚菌M.esculenta菌丝体的生长发育受Mn元素的影响较大，当Mn元素质量浓度为5 mg/L 时具有明显的促进作用。彭璐等[66]研究发现，K、Zn元素能有效地促进羊肚菌M.esculenta菌丝体的生长，而Mn元素的促进作用不明显，但Fe、Cu、Ca元素对菌丝体的生长则有抑制作用。Gursoy等[67]测定羊肚菌M.esculenta生理活性时发现，样品中均含有Cu、Mn、Zn、Fe、Ca、Mg、Co 7种元素。这些试验结果均反映不同羊肚菌生理特性的多样性。龙正海[68]研究发现，维生素B1、B2、B6、H和叶酸类物质对尖顶羊肚菌M.conica的生长有微弱的促进作用。刁治民等[65]研究发现，维生素B1、B2、B6、H和叶酸对羊肚菌M.esculenta菌丝生长也有明显的促进作用，而维生素B12和维生素C有抑制作用。朱永真[69]研究维生素(维生素B1、B2、B6、B12、烟酸及叶酸)对羊肚菌M.esculenta菌丝生长的影响时发现，烟酸对菌丝生长有明显的抑制作用，并且这种抑制作用随着烟酸浓度的增加而增强，其他维生素效果则不明显。从以上研究报道可见，不同维生素对羊肚菌的生长到底起何种作用，至今尚未形成统一的定论。

3羊肚菌生活史及其生活习性

3.1羊肚菌生活史

羊肚菌的生活史(Life Cycle)即从孢子到孢子的发育全过程(含有性生殖、无性生殖和菌核形成)。图1描述羊肚菌生活史的全过程，羊肚菌有性生殖成熟的表现是子囊果的形成，成熟子囊果是一个周期的终点，其明显特征是2个单倍体核配对后形成双倍体核，再经减数分裂形成新的单倍体子囊孢子，进而继续萌发形成菌丝。羊肚菌无性繁殖是由菌丝形成孢子囊梗，在顶端发育孢子囊，产生分生孢子，进而萌发产生单倍体核新菌丝的过程。此外，在环境因素不利的情况下，营养菌丝或异核菌丝都可直接形成菌核并使其处于休眠状态，当环境适宜时，菌核便会萌发成新的初生菌丝或次生菌丝，最终形成子实体[70]。

3.2羊肚菌的生活习性

对于羊肚菌的生活习性，学术界一直未有明确定论，目前普遍存在2种观点：一是认为羊肚菌属于单一的腐生型真菌；二是认为羊肚菌与某种高等植物可能存在菌根关系[11,71-73]。

自20世纪80年代以来，有关野生羊肚菌发生基质的调查研究报告均显示，此类菌为单一的腐生型真菌，与其他任何植物均未建立所谓的共生关系，因为无论羊肚菌孢子还是组织块都可以在简单的培养基上很快萌发并且生长迅速，即使完全没有植物存在也可能诱导出羊肚菌子实体[74-75]。Moser[76]研究认为，羊肚菌同时具有共生和腐生能力。Trappe等[77]讨论羊肚菌菌根性质，指出虽然羊肚菌具有腐生菌所具有的一系列特征，然而仍然有不同羊肚菌种类能与几种较大的树根形成不同的联系。而且就羊肚菌为腐生型真菌的各类文献报道可以看出，不同学者的观点也各异。曾荣鉴[78]调查后认为，羊肚菌应该是一种土生腐生型真菌；杨绍斌等[51]则根据不同的生长基质，将其认为是腐生型真菌的羊肚菌划分为腐朽木腐生型、腐殖质土腐生型、细沙质土腐生型3种。近几年，关于羊肚菌是腐生菌还是菌根菌争议依然存在，李能树等[79]调研发现，羊肚菌可与某种高等植物建立共生关系形成外生菌根；但张维瑞等[80]持相反态度，他们认为羊肚菌与木林、竹林等无任何关联，应为腐生菌；王伯彻[81]调查发现，羊肚菌是一种纯以地表腐殖质和土壤为基质生长的真菌。由此可见，关于羊肚菌的生活习性还有待菌物学家们深入研究。

图1　羊肚菌生活史示意图(引自Thomas, 1990)

4羊肚菌遗传多样性研究

4.1菌物遗传多样性概述

菌物遗传多样性(Fungal genetic diversity)是指在分子水平上对菌物多样性及其演化规律进行描述的科学，亦称为菌物基因多样性。早期的菌物系统发育研究主要依据个体的形态学和发育学等数据来进行分析和判断，21世纪以来，Kimura’s分子进化的中性理论(NTME)对生物进化与遗传学的研究产生巨大影响，现代分子生物学技术在菌物分类鉴定及遗传多样性研究中起着至关重要的作用。例如：聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，PCR)、核酸分子杂交技术(Nucleic acid hybridization)、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、同工酶分析(Isoenzymes analysis)、电泳核型分析(Electrophoretic karyotype analysis)、蛋白质免疫技术(Protein immune technology)、核酸序列分析(Nucleic acid sequence analysis)、限制性长度多态性(Restriction fragment length polymorphsm，RFLP)、扩增核糖体 DNA 限制性分析(Amplified ribosomoal DNA restriction analysis，ARDRA)、单链构象多态性(Single strand conformational polymorphisms，SSCP)、16S末端标记限制片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等。查阅近10 a的有关文献发现，目前国内外学者在羊肚菌遗传多样性研究中主要应用核酸序列分析(Nucleic acid sequence analysis)、同工酶分析(Isoenzymes analysis)和蛋白质免疫技术分析(Protein immune technology)3种方法，现将逐一阐述。

4.2羊肚菌核糖体DNA分析

遗传多样性的本质是遗传物质DNA分子的多态性表现，是DNA分子水平上遗传多样性的直接反映，由于核糖体DNA(rDNA)分子进化信息量大，可比性强，现已广泛用作生物发育系统学的分子指标。

以特定的引物可以对羊肚菌特定的核糖体DNA进行PCR扩增，并可进行进一步的测序与分析。Buscot[72]对多种羊肚菌Morchellaspp.的ITS和IGS序列进行PCR/RFLP分析，发现ITS区可以清楚地区分研究组群区，而IGS区只能区分亲缘关系非常接近的2个种区，这表明ITS区的应用范围要大得多，IGS区只能用于遗传距离较近种的亲缘关系鉴定。Bunyard等[82]对羊肚菌属Morchella和鹿花菌属Gyromitra的28 S rDNA进行PCR-RFLP分析，发现羊肚菌属Morchella与鹿花菌属Gyromitra的差异约为6.2%。Wipf等[83]对尖顶羊肚菌M.conica和羊肚菌M.esculenta的完整ITS序列进行测序分析，发现尖顶羊肚菌M.conica和羊肚菌M.esculenta的ITS序列存在长度差异，还发现二者的ITS1和ITS2片断间存在很高的多态性。随后，Wipf等[84]采用 PCR-RFLP技术分析羊肚菌属Morchella的11个种的ITS序列，通过最大简约法(Maximum pasimony)和邻接法(Neighbour joining)可以很明确区分黄羊肚菌类群和黑羊肚菌类群。杜习慧等[42]对在中国21个省收集的361株羊肚菌标本进行ITS区序列分析，并采用最大似然法(Maximum likelihood)和最大简约法(Maximum pasimony)构建系统发育树，结果显示，中国共有30种羊肚菌，其中有11种是新发现尚未命名的种类，该研究成果为中国第一部羊肚菌详细的分子系统发育评估报告。

4.3羊肚菌同工酶分析

生物进化历程中，变异基因经复制和分离形成不同位点，进而编码同工酶的不同亚基，使同工酶也可作为识别遗传基因的标记。龙正海等[85]研究发现，羊肚菌M.esculenta在不同生长时期，菌丝体内酯酶同工酶活性变化与其氨基酸含量变化存在一定的相关性；研究还发现，羊肚菌M.esculenta子实体与其菌丝体酯酶同工酶酶谱基本相同。Wipf等[83]对来自欧洲、美洲等地的不同羊肚菌的8种脱氢酶进行同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，通过对8种酶迁移率的分析可以得到不同羊肚菌的系统发生信息。王新宇等[86]研究发现，在相同培养液及相同培养条件下，羊肚菌M.esculenta、尖顶羊肚菌M.conica和黑脉羊肚菌M.angusticeps，菌丝体的生物量及可溶性蛋白质含量无显著差异，但同一个种在含不同浓度的麦芽糖、VB1和蛋白胨培养基上生长时，菌丝体生物量差异较大，同时酯酶同工酶的组分也有差异。

4.4羊肚菌蛋白质免疫分析

自1989年Futhrmann等研究发现酶联免疫吸附分析(Enzyme- linked immuno sorbent assay，ELISA)方法可以准确进行种类鉴定以来，真菌抗原的免疫学研究已经在该领域内得到广泛应用[87-88]。Jung等[89]将酶联免疫吸附分析法(ELISA)应用于羊肚菌的系统学研究，结果显示，半开羊肚菌M.semilibera与羊肚菌M.esculenta间的免疫学差异为27%；同时，两位学者认为，为更好揭示羊肚菌各种群间的免疫学关系和系统发育关系，可以利用蛋白质纯化物替代菌丝细胞提取物作为抗体对羊肚菌属Morchella进行免疫学研究。

5甘肃甘南藏族自治州野生羊肚菌资源研究现状及展望

甘南藏族自治州位于甘肃省西南部，地处青藏高原东北边缘向黄土高原和陇南山地的过渡地带，全区北纬33°20′～35°40′，东经100°52′～104°45′，海拔最低仅有800 m，而最高可达4 000 m，地势落差极大，地貌特征复杂多样，自然条件极端；境内有白龙江、黄河、洮河和大夏河，这“一江三河”是黄河、长江干流的重要水源涵养区，是维系黄河、长江中下游地区生态安全的天然屏障[90]。该地区属青藏高原气候带，高寒湿润气候区，年均气温4.5 ℃，年均降水量610.4 mm，年均蒸发量1 185.3 mm，年总日照时数2 396.0 h，日照率为54%[91]。由于自治州内部分地区的生物地理气候条件以及水文状况与诺尔盖湿地十分相似，从生物学多样性角度来看，可视其为诺尔盖湿地生态系统的一部分，是中国少有的集森林山地、高原湿地和高寒草甸三重功能为一体的自然生态环境区，在保护生物多样性方面具有全球战略意义[92]。该地区植被覆盖率高，生物群落稳定，其独特的气候特点造就丰富的生物资源，其中也为食(药)用真菌的发生提供优越的多样性生态条件，这其中就包括羊肚菌Morchellaspp.。目前，有关该地区羊肚菌资源研究的情况鲜有报道，早期顾龙云[43]开展甘肃甘南藏族自治州野生羊肚菌的考察工作，发现该地区有羊肚菌M.esculenta、尖顶羊肚菌M.conica、黑脉羊肚菌M.angusticeps、粗腿羊肚菌M.crasspies和小羊肚菌M.deliciosa5种，报道称后3种为甘肃省新纪录种，并发现其中有些黑脉羊肚菌M.angusticeps是生长在云杉林里枯枝落叶层下腐殖质中的腐木上。这一事实说明过去许多真菌学者笼统地认为“羊肚菌是以土壤有机质为营养的腐生菌”的说法是不确切的。罗植柚[93]研究报道甘南藏族自治州野生羊肚菌生态特征，初步发现当地野生羊肚菌生长发育的生态因子。康小虎等[94]对甘南藏族自治州尖顶羊肚菌M.conica进行液体发酵培养，以干菌丝体得率为指标，设计正交试验优化其液体发酵培养基和培养条件，结果发现，最佳培养基组合为白砂糖30 g/L、豆粕粉15 g/L、KH2PO40.75 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、维生素B 10.03 g/L；最优液体发酵条件为温度25 ℃，培养液初始pH 7.0，接种量10 mL，转速120 r/min，培养时间8 d。

到目前为止，有关甘肃甘南藏族自治州野生羊肚菌分子系统学方面的研究尚未见报道。因此，今后应从以下3个方面开展相关工作：(1)对甘肃甘南藏族自治州境内收集到的野生羊肚菌进行形态学初步分类，分别从子实体、菌丝体、菌核、菌落、孢子等方面进行形态和显微观察；(2)运用分子生物学技术对甘肃甘南藏族自治州境内收集到的野生羊肚菌进行分子鉴定，并对其系统发育关系进行分析研究；(3)以甘肃甘南藏族自治州境内已鉴定出的羊肚菌菌株为研究对象，运用生物学和统计学的研究方法拟合其液体菌种生长动力学模型，为今后羊肚菌的发酵培养及人工栽培数据图形化实现奠定基础。通过上述研究，可以明确甘南藏族自治州野生羊肚菌的种质资源及其系统发育关系，为羊肚菌筛选杂交亲本，早期预测杂种优势，减少育种中的盲目性等方面提供理论与实践基础，同时也为甘南藏族自治州大型经济真菌的利用与开发提供一定的依据。

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Received 2015-08-05Returned2015-11-12

Foundation itemThe Youth Science and Technology Innovation Foundation of Gansu Academy of Science (No.2013QN-05).

First authorWANG Long, male, associate research fellow. Research area: the microbial diversity and resource utilization from grassland. E-mail: wanglong-0106@163.com

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Research Progress of Species Diversity inMorchellaspp.

WANG Long, GUO Rui, LU Dengxue, QIN Peng and ZHAO Yuhui

(Key Laboratory of Microbial Resources Development and Utilization of Gansu Province, Industrial Microbial Engineering Technology Research Center of Gansu Province, Institute of Biology,Gansu Academy of Science, Lanzhou 730000, China)

AbstractAs a valuable and rare edible and medicinal fungus, Morchella spp. has very important economic and scientific values. In this paper, the recent achievement of Morchella spp. on traditional classification, ecological characteristic, life cycle, life habit and molecular biology etc. were summarized. In addition, the research development of wild Morchella spp. from Tibetan autonomous prefecture of Gannan in Gansu province were sketched. The potential issues which remained in the current research were pointed out, and some suggestions were given for future study.It will make a reference to sustainable development of wild Morchella spp. from Tibetan buddhism of Gannan in Gansu province.

Key wordsMorchella spp.; Species diversity; Molecular biology; Gansu province; Summary

收稿日期：2015-08-05修回日期：2015-11-12

基金项目：甘肃省科学院青年科技创新基金(2013QN-05)。

中图分类号S646.9

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)04-0477-13

网络出版日期：2016-04-02

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.002.html

第一作者：王龙，男，副研究员，从事草地微生物多样性及其资源利用研究工作。E-mail:wanglong-0106@163.com