基于扩散理论的生物组织固有荧光光谱复原方法研究

刘 勇、张元志、候华毅、朱 灵、王 安、王贻坤*

1. 中国科学院合肥物质科学研究院应用技术研究所、安徽省生物医学光学仪器工程技术研究中心、安徽 合肥 230031 2. 皖江新兴产业技术发展中心、安徽 铜陵 244000

基于扩散理论的生物组织固有荧光光谱复原方法研究

刘 勇1,2、张元志1、候华毅1、朱 灵1,2、王 安1、王贻坤1,2*

1. 中国科学院合肥物质科学研究院应用技术研究所、安徽省生物医学光学仪器工程技术研究中心、安徽 合肥 230031 2. 皖江新兴产业技术发展中心、安徽 铜陵 244000

组织固有荧光光谱定义为未受生物组织吸收、散射作用影响的荧光光谱、能够直接反映组织微观结构和生物化学性质信息。为了减少吸收和散射特性对组织荧光光谱的干扰、从实测的组织荧光光谱中复原更能反映组织荧光特性的组织固有荧光光谱、搭建了基于光纤探头的组织光谱测量系统、实现生物组织相同位置处的荧光光谱和漫反射光谱测量。提出运用扩散理论从实测的漫反射光谱中提取组织生理参数、包括组织中血液体积分数、血氧饱和度、黑色素含量以及波长500 nm处约化散射系数和瑞利散射在总散射中的比例、进而计算可见波段范围内的组织光学参数； 然后、根据组织光学参数和实测的漫反射光谱、从实测的荧光光谱中复原得到组织固有荧光光谱。进行临床试验验证、采集受试者皮肤组织荧光光谱与组织漫反射光谱、并复原皮肤固有荧光光谱。通过复原得到的固有荧光光谱反映人体皮肤糖基化终产物积聚量、并最终用于糖尿病无创筛查。结果显示、分别使用实测的荧光光谱和复原得到的固有荧光光谱用于糖尿病筛查时、在特异性水平同为75%时、敏感性分别为69%和90%。

生物医学光学； 扩散理论； 漫反射光谱； 光学参数； 固有荧光光谱

引 言

组织荧光光谱技术具有无创、实时、灵敏度高等显著优点、在癌组织检测[1]、光动力治疗[2]等领域具有广阔的应用前景。然而、由于组织吸收和散射会使入射到组织中的激发光和组织吸收激发光后再发射的荧光产生畸变、从而导致光谱测量系统实测的原始荧光光谱无法反映组织固有荧光特性、影响其临床应用效果。为从实测的原始荧光光谱中复原出更能反映组织荧光特性的固有荧光光谱、国内外研究者提出了多种组织荧光光谱复原算法。其中、Mayevsky等[3]和Hull等[4]提出一种基于经验方法的荧光光谱复原算法、通过使用荧光光谱减去或者除以部分组织漫反射光谱以补偿组织吸收、散射的作用。Müller等[5]和Wu等[6]从辐射传输方程出发、提出光子迁移理论、直接推导出组织荧光光谱和组织漫反射光谱的关系、进而使用组织漫反射光谱复原组织荧光光谱。Ramanujam[7-9]使用蒙特卡洛方法对组织漫反射光谱进行模拟、提取组织光学参数、然后将提取的光学参数输入蒙特卡洛荧光模型进行组织荧光光谱复原。经验方法实现简单、但缺乏严密的理论支持、且其中直接影响复原效果的经验参数缺乏有效的选取方法； 光子迁移理论直接建立了组织漫反射光谱与组织荧光光谱的关系、但未提取反映组织生理信息的光学组织光学参数、无法直接反映光学参数对组织漫反射光谱和组织荧光光谱的影响； 蒙特卡洛方法可用于模拟组织中任意光学参数的光传输、但其计算量巨大、耗时多、在实际临床中的应用受到限制。

本文搭建了基于光纤探头结构的组织光谱测量系统、实现受试者组织荧光光谱和组织漫反射光谱的测量。在半无限媒质、零边界情况下、对扩散方程进行求解、从组织漫反射光谱中提取组织生理参数、并进一步计算可见光波段内的组织吸收和散射系数。通过构建组织荧光模型、利用组织光学参数和组织漫反射光谱、从实测原始荧光光谱中复原得到能直接反映组织荧光特性的固有荧光光谱。此外开展临床试验、对皮肤组织荧光光谱进行测量及复原、并将其应用于糖尿病无创、快速筛查。

1 原理和方法

1.1 组织光学参数提取

扩散方程(diffuse equation,DE)模型是对辐射传输方程的一阶球谐展开近似、可表示为相对简单的椭圆型偏微分方程形式、能够模拟任意几何形状和光学参数分布下组织体内光的传播行为[10]。在半无限媒质、外推边界条件下、对扩散方程进行求解、可得距离源r处、媒质表面的相对反射光强R

(1)

生物组织体中的吸收物质主要包括黑色素、血红蛋白、水、脂肪等[11]。其中、黑色素是皮肤表皮层中的主要吸收物质、其浓度与皮肤白皙程度和色斑形成有直接关系、适当浓度的黑色素能阻挡过量的紫外线辐射对皮肤的影响、健康人表皮层黑色素浓度在1%～10%之间。皮肤中含氧血红蛋白、脱氧血红蛋白与皮肤组织微循环状态有关、反映了组织代谢能力的强弱、健康人皮肤含氧血红蛋白与脱氧血红蛋白的总浓度即总血红蛋白含量在0.2%～7%之间、而含氧血红蛋白在总血红蛋白中所占比例、即血氧饱和度在0%～100%之间。皮肤组织中的水分含量是影响皮肤弹性和生理状态的重要指标、健康人皮肤的水分含量在15%～70%之间。皮下脂肪是生物体的重要组成部分和储能物质、健康人皮肤中脂肪含量在15%左右。然而在可见波段范围内、水和脂肪的吸收很小、皮肤组织吸收主要来源于血红蛋白与黑色素、皮肤组织吸收系数可用式(2)描述； 此外、皮肤组织中非均匀的分布着许多散射颗粒、会对入射到皮肤组织的光造成不同程度的散射(包括瑞利散射和米散射)、皮肤组织散射系数可用式(3)描述。

(2)

(3)

在此基础上、测量距离源r处组织漫反射光谱Rm(λ)、并计算实测漫反射光谱与预测漫反射光谱之间的误差∑(Rm(λ)-Rp(λ))2。通过相关优化算法、使该误差最小、则可得到皮肤组织生理参数：血液体积分数、血氧饱和度、黑色素浓度、组织散射特性参数、并进一步得到组织在可见波段内吸收系数和约化散射系数。

1.2 组织固有荧光光谱复原

入射到组织的光束、一部分直接被组织表面反射(称为镜面反射)、另一部分进入组织、折射后依次进入表皮和真皮、并被组织散射与吸收。被吸收的光一部分直接转换为热或者分子的某种震动、另一部分会造成荧光发射。散射光中一部分一直向前形成透射光、一部分重新返回组织表面而进入空气中、称为漫反射光。组织荧光与对应波段的漫反射光在组织中经历了相似的路径、二者关系可近似用式(4)表示。

Fx,m=SRm

(4)

式中、S包含两个部分：(1)入射到组织中(S1)； (2)被荧光团吸收并产生荧光(S2)。

根据扩散理论、当激发光照射皮肤组织、会有部分光被皮肤组织反射回来、反射光强度可用下式表示[12]

(5)

S1=1-Rx

(6)

而被组织吸收并产生组织荧光的部分可表示为

(7)

其中、μaf,x表示荧光团的吸收、μa,x表示组织总吸收、将式(6)—式(7)代入式(4)可得荧光光谱Fx,m。

(8)

变换后可得组织固有荧光fx,m。

(9)

由式(9)可知、当已知组织吸收和散射系数、组织荧光光谱和漫反射光谱时、可复原该点的组织固有荧光光谱。组织荧光光谱及漫反射光谱可通过搭建测量系统直接获取； 组织吸收和散射系数可使用前述的扩散光模型从组织漫反射光谱中提取。

1.3 组织光谱测量系统

糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)是指在非酶条件下、蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的终末产物[13]。临床研究表明、人体皮肤组织中的AGE含量与糖尿病及其慢性并发症密切相关、有效检测皮肤组织中的AGE积累水平、可用于糖尿病无创筛查[14]。AGE具有受激/发射荧光特性、可以根据皮肤组织光谱信息反映皮肤中AGE积累水平、进而临床上用于提示糖尿病。

搭建如图1所示的组织光谱测量系统、实现了组织荧光光谱和组织漫反射光谱测量。

图1 组织光谱测量系统结构框图

组织光谱测量系统主要包含光源模块、传输光路、探测模块、信号分析和处理模块。光源模块包括用于荧光激发的激发光源和用于产生组织漫反射光谱的宽带光源。激发光源可根据需要选择、本系统中采用的是近紫外LED； 宽带光源采用多LED阵列组成、光谱范围覆盖了荧光激发及发射波段。传输光路主要由3×1型光纤束构成、分别连接激发光源、宽带光源、探测模块以及待测组织。探测模块采用微型光谱仪。信号分析与处理单元是包含光谱测量过程控制、信号处理以及结果显示等软件程序的计算机。

图2 人体皮肤漫反射光谱与荧光光谱

2 结果与讨论

使用上述组织光谱测量系统采集76例受试者(糖尿病患者30例、健康对照46例)的皮肤荧光光谱和皮肤漫反射光谱(文中皮肤漫反射光谱特指系统测量的皮肤组织漫反射光谱与相同条件下测得的标准漫射板反射光谱之比、默认标准漫射板在可见波段内反射率为100%)。图2(a)为数据集中随机抽取3例糖尿病患者和3例健康对照的皮肤漫反射光谱； 图2(b)为相应受试者实测的皮肤荧光光谱。

将实测的皮肤漫反射光谱代入前述的组织光学参数提取模型。使用遗传算法进行参数优化、通过不断迭代使预测光谱与实测光谱误差最小、可提取组织生理参数、并进一步计算组织在可见波段内的光学参数。图3中虚线表示实测的皮肤漫反射光谱； 相应的实线表示预测的皮肤漫反射光谱、两条曲线形状和强度的差距都很小。未完全重合的原因可能包括：求解扩散方程时、对其边界条件作了一定的假设； 另外计算组织吸收系数和约化散射系数时、未考虑皮肤组织中胡萝卜素等的影响。

图3 实测人体皮肤漫反射光谱与拟合得到的目标光谱

利用组织光学参数提取模型对全部受试者皮肤组织进行生理参数提取、结果如表1所示。图4(a)—图4(e)分别显示受试者皮肤组织中血液体积分数、血氧饱和度、黑色素体积分数、波长500 nm处组织约化散射系数和瑞利散射在总散射中的比例的分布情况。

依次对受试者皮肤组织相关生理参数进行独立样本t检验分析、得到健康对照组及糖尿病患者组的各生理指标均无显著性差异(p>0.05)、也即是说是否患有糖尿病并不会直接导致表1中所述的组织生理参数发生变化。

将所提取的受试者生理参数代入式(2)和式(3)、可计算出受试者可见波段内的组织吸收系数和散射系数。图5(a)为前述3例糖尿病患者和3例健康对照皮肤组织350～600 nm范围内的吸收系数、图中显示吸收系数在383和566 nm处均存在极小值、而在416、539和577 nm处存在极大值； 图5(b)为受试者皮肤组织350～600 nm波段的约化散射系数、由图可看出约化散射系数随波长的增加而逐渐降低。波长为383、416、539、566和577 nm时、受试者皮肤组织吸收系数、散射系数如表2所示。

表1 人体皮肤生理参数

受试者皮肤组织吸收系数和约化散射系数提取后、将实测的原始荧光光谱、组织漫反射光谱以及提取到的组织光学参数代入式(9)、复原得到皮肤组织固有荧光光谱。图6显示前述3例糖尿病患者和3例健康对照皮肤组织固有荧光光谱。分析图2(b)、可发现糖尿病患者和健康对照实测荧光光谱曲线在480～490 nm范围内都存在一个极大值、而且1号糖尿病患者的荧光光谱在505～515 nm范围内还存在另一个强度相近的峰值、即糖尿病患者与健康对照荧光光谱曲线形状存在明显差异； 另外1号糖尿病患者荧光光谱强度要低于3例健康对照。而图6中复原得到的糖尿病与健康对照组织固有荧光光谱光谱曲线形状保持一致、同样在480～490 nm波段内存在一个极大值、值得注意的是1号糖尿病患者荧光光谱强度不再弱于3例健康对照、糖尿病患者皮肤荧光强度要均高于健康对照。对于糖尿病患者而言、体内的高血糖环境会加快糖基化终产物的产生、但并不会影响组织一般光学参数、所以糖尿病患者和健康对照荧光光谱曲线形状应该一致； 且由于糖尿病患者体内糖基化终产物水平往往较高、其荧光光谱一般会比正常人强、显然复原的皮肤荧光光谱更为合理。

图4 人体皮肤生理参数分布

图5 人体皮肤吸收系数与散射系数

表2 波长383,416,539,566及577 nm处，人体皮肤典型光学参数

图6 复原后的人体皮肤固有荧光光谱

对所有受试者进行皮肤固有荧光光谱复原后、以可见波段内荧光光谱积分强度作为输入变量、以受试者糖尿病患病情况作为状态变量、进行ROC曲线分析、结果如图7所示。图中虚线表示实测原始荧光光谱强度ROC曲线分析结果、实线代表复原的固有荧光光谱强度ROC曲线分析结果。对于前者、当选取特异性为75%时、其敏感性为69%； 对于复原后的固有荧光光谱、当选取相同特异性时、其敏感性可达90%、明显高于前者。据文献报道、使用空腹血糖、糖化血红蛋白及组织荧光诊断糖尿病、当特异性为77.4%时、对应的敏感性分别为58.0%、63.8%和74.7%[15]。由此可见、通过皮肤固有荧光筛查糖尿病具有更高的敏感性和特异性。

图7 光谱复原前后、组织荧光筛查糖尿病的ROC曲线

3 结 论

基于扩散理论计算距光源特定距离处的组织漫反射光谱、与实测的组织漫反射光谱进行迭代优化、提取组织生理参数、并进一步计算可见波段范围内的组织光学参数； 根据提取的组织光学参数和实测的组织漫反射光谱、从实测组织荧光光谱中复原组织固有荧光。使用搭建的组织光谱测量系统、测量受试者皮肤组织荧光光谱和组织漫反射光谱、进行实验验证。结果显示基于扩散理论的组织固有荧光光谱复原方法、可以显著改善组织荧光光谱临床应用效果。

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*Corresponding author

Tissue Intrinsic Fluorescence Spectrum Recovering Based on Diffusion Theory

LIU Yong1,2,ZHANG Yuan-zhi1,HOU Hua-yi1,ZHU Ling1,2,WANG An1,WANG Yi-kun1,2*

1. Institute of Applied Technology,Hefei Institutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences,Anhui Provincial Engineering Technology Research Center for Biomedical Optical Instrument,Hefei 230031,China 2. Wanjiang Center for Development of Emerging Industrial Technology,Tongling 244000,China

Tissue intrinsic fluorescence spectrum refers to the fluorescence that is not impaired by tissue absorption and scattering which has the ability to reflect tissue biochemical properties. In order to reduce the influence of tissue absorption and scattering properties on tissue fluorescence spectrum,and then recover tissue intrinsic fluorescence spectrum,a tissue spectrum detection system based on fiber-optic probe was developed for the measurement of tissue fluorescence spectrum and diffusion reflectance spectrum at the same place. On the other hand,diffusion theory was introduced to extract the tissue physiological parameters from the measurement tissue diffusion reflectance spectrum,which included blood volume fraction,oxyhemoglobin saturation,melanin content,reduce scattering coefficient at 500 nm and the ratio of rayleigh scattering and the total scattering. Then tissue optical parameters in visible wavelengths were calculated. According to the tissue optical parameters and measured tissue diffusion spectrum,the intrinsic fluorescence spectrum was recovered from the measured fluorescence. Based on this,clinical trials were conducted to measure human skin fluorescence spectrum and diffusion reflectance spectrum,and then to recover skin intrinsic fluorescence spectrum. Finally,the accumulation of Advanced Glycation End products (AGE) in human skin was evaluated and the probability of diabetes mellitus was predicted. The result shows that the sensitivity and specificity were 69% and 0.75% respectively,when the measured fluorescent was used to screening diabetes mellitus. At the same specificity,the sensitivity was 90% when the recovered intrinsic fluorescence was employed to screening diabetes mellitus.

Biomedical optics; Diffusion theory; Diffusion reflectance spectrum; Optical parameters; Intrinsic fluorescence spectrum

Sep. 2,2015; accepted Jan. 22,2016)

2015-09-02、

2016-01-22

国家科技支撑计划项目(2015BAI01B04)和安徽省科技攻关计划项目(1301042121)资助

刘 勇、1969年生、中国科学院合肥物质科学研究院应用技术研究所研究员 e-mail: Liuyongcas@gmail.com *通讯联系人 e-mail: wyk@aiofm.ac.cn

R318.5

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3836-06