异丙酚对胃癌HGC-27细胞侵袭能力的影响

马浩文，夏中元，赵 博，刘 敏，侯家保

武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060

异丙酚对胃癌HGC-27细胞侵袭能力的影响

马浩文，夏中元，赵 博，刘 敏，侯家保

武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060

目的 观察异丙酚对人胃癌HGC-27细胞侵袭能力的影响，并探讨可能的作用机制。方法 体外培养HGC-27细胞，分为对照组和实验组，实验组用不同浓度(5、10、20 μg/mL)异丙酚处理HGC-27细胞24 h，对照组加入等体积的培养基，Transwell小室实验检测细胞侵袭能力；Western blotting 检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Akt、p-Akt及 p-GSK-3β的表达。结果 与对照组比较，异丙酚可显著降低HGC-27细胞侵袭能力；异丙酚处理后，MMP-9表达下调；异丙酚可抑制p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β的表达。结论 异丙酚可降低人胃癌HGC-27细胞侵袭能力，其机制可能与抑制Akt通路、下调MMP-9表达有关。

异丙酚；HGC-27细胞；侵袭；基质金属蛋白酶-9；Akt信号通路

肿瘤的主要治疗方式是外科手术切除，外科手术通常在全身麻醉下进行，但麻醉药物可抑制机体免疫反应，手术过程中也可能引起癌细胞向周围组织或血液中扩散，因此，手术过程中很容易发生肿瘤细胞的转移和扩散[1]。目前异丙酚是临床最常用的静脉麻醉药物之一。研究[2-3]发现，异丙酚对人结肠癌LoVo细胞、黑色素瘤RMPI-7951细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人纤维素瘤HT1080细胞和人骨肉瘤细胞HOS细胞等多种肿瘤细胞的侵袭能力均有抑制作用。

研究[4-5]证实，Akt信号通路在细胞代谢、增殖、凋亡及侵袭转移等过程中起重要调控作用，异常或过度激活的Akt通路可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡并促进细胞侵袭转移。异丙酚对胃癌HGC-27细胞侵袭能力的作用尚不清楚，本研究旨在探讨异丙酚对胃癌HBC-27细胞侵袭能力的影响，探讨其对Akt信号通路的影响，并分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料细胞株：胃癌HGC-27细胞，购自中国科学院上海细胞库；主要试剂：异丙酚注射液(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI 1640培养液(碧云天生物技术研究所)；Transwell小室(Corning公司)；Matrigel胶(BD公司)；辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(武汉博士德生物科技有限公司)；Akt、p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)、MMP-9及 β-actin抗体(购自Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：细胞接种到培养瓶中后置于37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中，培养2～3 d后观察培养基颜色及培养瓶内细胞长势，若培养基颜色变淡而细胞未长满则将培养瓶从培养箱中取出，在无菌操作台上操作，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2～3遍，加入适量新培养基，继续放入培养箱中培养。实验分为4组：对照组、5 μg/ml异丙酚组、10 μg/ml异丙酚组和20 μg/ml异丙酚组，作用时间均为24 h。

1.2.2 Transwell法检测细胞侵袭能力：将Matrigel胶放置于4 ℃冰箱过夜，用4 ℃预冷的无血清培养基稀释融化后的Matrigel胶至终浓度为1 mg/ml；将100 μl稀释后的Matrigel胶加入Transwell小室底部中间区域，让胶体自由向四周扩散，使其均匀铺在小室底部，37 ℃温育5 h使其干成胶状；实验前将细胞培养试剂和Transwell小室放在37 ℃条件下预热；将对数生长期的各组细胞血清饥饿12 h，收集细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，1 500 r/min(离心半径3 cm)离心5 min后，用无血清培养基重悬计数，调整细胞密度为2×105/ml左右；将600 μl含10%血清的培养基加入24孔板底部，150 μl细胞悬液加入Transwell小室内，用镊子将小室转移至含10%血清的培养基的24孔板中，继续在细胞培养箱中培养24 h；24 h后，用镊子小心取出小室，吸干小室内培养基，用经PBS湿润的棉签轻轻拭小室内的细胞后将小室移到含800 μl甲醇的孔中，室温下放置固定30 min；取出小室并吸干室内固定液，移到含结晶紫染液的孔中，室温下放置染色15 min；用清水浸泡并轻轻冲洗数次，然后取出小室，吸去上室液体，用镊子小心揭下膜，底面朝上晾干；显微镜下取5个随机视野计数，统计结果。

1.2.3 Western blotting检测Akt、p-Akt (Ser473)、p-GSK-3β (Ser9)及MMP-9蛋白表达：细胞接种及分组同上，收集细胞，用冷的PBS洗涤3遍，弃去PBS，加入三去污蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，用双蒸水泡过的细胞刮收集瓶中液体于EP管中，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，吸取上清，置于-80 ℃冰箱储存。BCA法测定蛋白质浓度，加入5×上样缓冲液至提取的细胞蛋白样品中，沸水煮沸5 min使蛋白变性。将胶板固定在电泳架上，加入电泳缓冲液，每孔加入40 μg蛋白样品，同时在两侧的上样孔中加入5 μl蛋白Marker作为分子量参照。电泳结束后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，根据条带蛋白分布不同加入1∶1 000稀释的兔抗人Akt、p-Akt(Ser473)及p-GSK-3β (Ser9)抗体，放入4 ℃冰箱内摇床上孵育过夜，其中β-actin为内参，次日TBST洗膜后，根据一抗来源不同分别加入1∶1 000稀释的辣根酶标记的山羊抗兔二抗，室温放置2 h，再次TBST洗膜，使用ECL化学发光试剂，在室温下孵育PVDF膜后放入暗盒中，暗室红灯下曝光1 min，然后显影、定影，对胶片进行拍照分析。

2 结果

2.1 异丙酚对胃癌HGC-27细胞侵袭能力的影响5、10、20 μg/ml浓度异丙酚处理HGC-27细胞24 h后，随着药物浓度的增加，穿过Trasnwell小室基底膜的细胞数逐渐减少，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明异丙酚可降低胃癌HGC-27细胞侵袭能力(见图1、图2)。

2.2 异丙酚对胃癌HGC-27细胞MMP-9表达的影响0、5、10、20 μg/ml浓度异丙酚处理HGC-27细胞24 h后，Western blotting检测结果显示随着药物浓度的升高，MMP-9表达逐渐降低(见图3)，表明异丙酚可下调胃癌HGC-27细胞MMP-9表达。

图1 异丙酚对胃癌HGC-27细胞侵袭能力的影响A:对照组(0 μg/ml异丙酚)；B:5μg/ml异丙酚组；C:10μg/ml异丙酚组;D: 20μg/ml异丙酚组

注：与对照组(0 μg/ml异丙酚)比较，#P<0.05。

2.3 异丙酚对胃癌HGC-27细胞Akt信号通路的影响HGC-27细胞经不同浓度异丙酚(0、5、10、20 μg/ml)处理24 h后，细胞总Akt表达量没有变化，而p-Akt表达减少，同时，Akt下游效应蛋白p-GSK-3β表达也减少，且呈浓度依赖性(见图4)。表明异丙酚能抑制HGC-27细胞Akt磷酸化，并抑制下游蛋白的活性，即抑制HGC-27细胞Akt信号通路。

图3 不同浓度异丙酚对胃癌HGC-27细胞MMP-9表达的影响

图4 不同浓度异丙酚对HGC-27细胞Akt信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

肿瘤侵袭和转移是导致临床治疗失败和患者死亡的主要原因。异丙酚对胃癌HGC-27细胞侵袭作用尚未见报道，本研究以人胃癌HGC-27细胞为对象，观察异丙酚对胃癌HGC-27细胞侵袭能力的影响，探讨其对MMP-9和Akt信号通路的影响。本实验结果发现异丙酚处理后，HGC-27细胞侵袭能力随着药物浓度的增加逐渐降低，MMP-9表达量也逐渐降低。

细胞外基质及基底膜的降解破坏在肿瘤细胞从原发灶脱离穿过组织屏障，导致细胞侵袭转移过程中起着关键作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶，可降解细胞外基质、破坏基底膜，促进肿瘤的侵袭转移。MMP-9是MMPs中明胶酶的一种，在多种肿瘤中表达上调，可降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原，参与肿瘤的侵袭转移[6-7]。本实验采用Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力，其原理是将Matrigel胶铺在人工膜表面，模拟体内的细胞外基质，肿瘤细胞必须借助自身分泌的一些蛋白酶破坏细胞外基质后才可通过人工膜，继而反映肿瘤细胞的侵袭力强弱。结果提示异丙酚可通过下调MMP-9表达降低HGC-27细胞侵袭能力。

Akt信号通路是调控细胞生长、凋亡、侵袭转移等过程中的关键组成部分，在肿瘤发生、发展过程中起重要调控作用。Akt及p-Akt在多种肿瘤细胞中过表达，p-Akt是Akt的活化形式，Akt磷酸化激活后，可对下游相关蛋白包括BAD、GSK-3β、NF-κB等进行调节，最终促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。研究[8-9]发现，Akt激活后可通过激活MMP-9及MMP-2，促进肿瘤细胞侵袭转移。本研究进一步发现HGC-27细胞经异丙酚作用后，Akt总的表达量没有变化，而p-Akt及Akt下游效应蛋白p-GSK-3β表达均减少，且呈浓度依赖性，表明异丙酚可抑制HGC-27细胞Akt信号通路。本研究结果提示异丙酚可能通过抑制Akt信号通路、下调MMP-9表达，进而降低HGC-27细胞侵袭能力。

综上所述，本研究结果提示异丙酚在体外能降低胃癌HGC-27细胞侵袭能力，其作用机制可能是通过抑制Akt信号通路进而下调MMP-9表达，其对其他肿瘤细胞作用及其抗肿瘤机制尚需进一步探索和研究。

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(责任编辑：马 军)

Effect of Propofol on the invasiveness of HGC-27 gastric cancer cells

MA Haowen, XIA Zhongyuan, ZHAO Bo, LIU Min, HOU Jiabao

Department of Anesthesiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China

Objective To investigate the effect of Propofol on the invasiveness of HGC-27 gastric cancer cells and explore the possible mechanisms. Methods HGC-27 cells were cultured in vitro, and then they were divided into two groups:control group and Propofol treatment group. The control group

only the culture medium. After treatment by Propofol at different concentrations (5, 10 and 20 μg/ml) respectively for 24 h, the invasiveness of HGC-27 cells was tested by transwell assay. Western blotting was used to detect MMP-9, Akt, p-Akt and p-GSK-3β. Results Compared with control group, the invasiveness of HGC-27 cells was significantly decreased in Propofol treatment group. Western blotting showed that Propofol decreased the expressions of MMP-9, p-AKT and downstream effector of p-GSK-3β in a dose-dependent manner. Conclusion Propofol inhibits the cell invasiveness of HGC-27 cells, and the effects of antitumor may be associated with inhibition of the Akt signaling pathway, thus down-regulating the expression of MMP-9.

Propofol; HGC-27 cells; Invasiveness; MMP-9; Akt signaling pathway

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.007

马浩文，硕士，研究方向：临床麻醉及危重医学。E-mail: mahaowenmzk@163.com

夏中元，博士，主任医师，博士生导师，研究方向：临床麻醉及危重医学。E-mail: xiazhongyuanmzk@163.com

R735.2

A

1006-5709(2016)06-0623-03

2015-08-31