高致病性猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病混合感染的诊断

（信阳农林学院牧医工程学院，河南 信阳 464000）

高致病性猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病混合感染的诊断

连慧香

（信阳农林学院牧医工程学院，河南 信阳 464000）

为了解信阳某猪场发病仔猪死亡原因，通过流行病学调查、病理解剖、伪狂犬病毒PCR检测、PRRSV的PCR检测、PRRSV分离株ORF5基因的PCR扩增及序列分析等方法，对该猪场发病猪进行了诊断。结果表明，该猪场猪只为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV)和伪狂犬病病毒（PRV）的混合感染。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪伪狂犬病毒；混合感染；诊断

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome）又称猪蓝耳病，该病以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病为主要临床特征。自1997年报道以来，PRRS在我国不断有发生，特别是2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HPPRRSV）毒株出现以来，被认为是猪“高热病”的主要病原[1-2]，HP-PRRSV在我国不同规模的养猪场流行，且常与猪瘟、猪圆环病毒病等多种病混合感染，不仅给诊断带来很大的麻烦，还常常耽误治疗，也给养猪业的疾病防控带来巨大挑战[3]。猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）是一种由伪狂犬病毒引起的急性传染病[4]，以母猪的繁殖障碍、仔猪的高死亡率且伴有严重神经症状为特征,也是目前严重影响中国养猪业发展的重要疫病之一。

笔者就一起高致病性猪繁殖与呼吸综合征及猪伪狂犬病混合感染病例的诊断进行报道。现将详细情况报道如下：

1 材料与方法

1．1 材料

豫南地区某猪场送检的3头发病仔猪。

1．2 试剂

TaKaRa LA Taq，RNAiso Plus，RNase inhibitor（40U/μL），M-MLV（Rnase H-）（200U/μL），dNTP Mixture，Premix Ex TaqTM试剂，PMD18-T vector，DNA Marke等工具酶均为大连宝生物公司（TaKaRa）产品；RNA抽提试剂盒，胶回收试剂盒均购于爱思进生物技术（杭州）有限公司；大肠杆菌（DH5α）为广西大学动物科技学院惠赠。

1．3 流行病学调查及病理剖解

通过询问畜主了解猪群发病情况，按常规方法对送检病猪进行剖解，观察病猪脏器的病理变化。

1．4 实验室诊断

1.4.1 细菌的分离

在无菌条件下，采集病死猪各组织，进行细菌划线分离。

1.4.2 PRV的PCR检测

将该猪场死亡的仔猪在无菌操作下分别采集脑、肺脏、肝脏、脾脏等组织，常规方法进行研磨，-20 ℃反复冻融3次后，抽提DNA,应用PCR方法分别进行PRV的检测。PRV引物序列：F：5'-CACGGAGGACGAGCTGGGGC T-3’，R：5'-GTCCACGCCCCGCTT GAAGCT-3’，扩增片段217 bp；PCR扩增反应体系（25μL/样品）：LA Taq(5U/μL)0.5 μL，2×GCBuffer12.5 μL，dNTP mixtue2 uL，上下游引物各（10μM/L）各1.0 μL，模板DNA3μL，补水至25μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4.3 PRRSV的检测

1.4.3.1 病料的处理和总RNA的提取

将病料剪碎研磨，反复冻融3次后8 000 r/min离心5 min，取上清液，采用Trziol法抽提病毒的总RNA，RT扩增条件：42 ℃恒温作用1 h，95 ℃5 min，合成的cDNA-20 ℃保存备用或者直接用于之后的PCR反应。

1.4.3.2 病料的检测

以上述cDNA作为模板，PRRSV检测引物序列：F：5'-AAGCTGTT AAACAGGGAGTGG-3'，R：5'-C CAAAGAATACCAGCCCATCA-3’，扩增片段443 bp；PCR扩增反应体系（25μL/样品）：上、下游引物（10μM/ L）各1.0μL，Taq Mix12.5μL，RNase Free dH2O7.5μL，cDNA3μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物通过凝胶（1.2%琼脂糖）电泳进行检测。

1.4.4 PRRSV阳性毒株ORF5基因的扩增及序列分析

利用ORF5引物对PRRS阳性标本进行PCR扩增，PRRSVORF5引物序列：F：5'-AGGTGGGCAACCGTTTTA-3'，R：5'-CATCACTGGCGTGTAGGT AAT-3'，扩增片段738 bp；反应体系50 μL/样品：cDAN2 μL，LATaq（5 U/μL）（TaKaRa）0.5μL，10×LA Taq Buffer 5μL，dNTPs（2.5 mMeach）8 μL，上、下游引物（10 μM/L）各1.0 μL，RNase Free dH2O32.5μL。ORF5基因PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用10%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。产物胶回收纯化后与PMD-18T载体连接，用ORF5引物进行菌液PCR鉴定，筛选阳性克隆，抽提质粒经酶切鉴定正确后送至上海杰李公司进行序列测定。测序所获得的基因序列应用生物软件Lasergene分析。

2 结果

2．1 流行病学调查及病理解剖

该猪场存栏繁殖母猪55头，后备母猪50头，公猪4头，断奶前仔猪180头，育肥猪300头。2015年12月未断奶仔猪与育肥猪相继出现了体温升高、呼吸困难、部分病猪耳朵、四肢内侧、腹部发绀，拉黄色稀粪，个别仔猪还出现转圈等症状,随后倒地死亡。同时，该场怀孕母猪出现流产、早产、产死胎等现象。发病初期使用黄芪多糖、多种抗生素治疗效果不佳，疫情迅速扩散至全场。

剖检可见肺实变、肿胀；全身多处淋巴结肿大、出血；喉头有点状出血；肾肿大表面有出血斑，脾肿大表面有出血点，膀胱内膜有散在出血点。

2．2 PRV的PCR检测

将采集的病料经常规方法处理后，提取总DNA为模板，进行PCR扩增。结果见图1，扩增出一条约217 bp的片段，因此判定该死亡猪只感染了PRV。

2．3 PRRS的检测结果

2.3.1 PCR检测

图1 伪狂犬病毒的PCR检测

图2 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测

将病料按常规方法处理后，提取基因组作为模板，进行PCR扩增并经琼脂糖电泳，结果见图2，扩增出一条443 bp左右的片段，因此判定死亡猪只感染了PRRSV。

2.3.2 ORF5基因的扩增及序列分析

PCR扩增结果显示，得到的核苷酸片段与预期结果大小符合，为738 bp（图3）。暂命名为HN-XY株。

利用Lasergene软件分析HN-XY株与国内外已发表毒株的ORF5序列核苷酸同源性，结果显示分离株与高致病性代表株JXA1和HUN4的核苷酸同源性最高为99.2%和99.3%（图4）。系统遗传进化树表明分离株与JXA1同属一分支，而与中国第一分离株CH-1a亲缘关系较远，处于不同的分支（图5）。表明分离株为高致病性PRRSV。

图3 PRRSV阳性毒株ORF5基因PCR扩增

图4 分离毒株与参考毒株ORF5基因核苷酸同源性比对结果

图5 基于ORF5核苷酸序列遗传进化树

4 讨论

通过流行病学调查、病理解剖、伪狂犬病毒PCR检测、PRRSV的PCR检测、PRRSV分离株ORF5基因的PCR扩增及序列分析等方法对信阳市某猪场发生疫情的病例进行实验室诊断，综合分析可以确诊该场猪发生的疫病为高致病PRRSV和伪狂犬混合感染。

目前，对于PRRS并没有特异性的治疗方法，做好PRRS的防控工作尤为重要，PRRS疫苗的应用为预防和控制PRRS的发生发挥了巨大的作用[5-6]。但是PRRS的不断变异和新毒株的层出不穷[7-8]，为依赖疫苗进行防控带来了挑战。疫苗免疫效果根据疫苗株与野毒株之间同源性的高低而不同，对变异较大的病毒株交叉免疫保护性较低，免疫效果不理想。由于该场使用的疫苗为传统的PRRSV弱毒疫苗，这对普通PRRS保护是有效的，但对高致病性的PRRS的交叉保护比较差，远达不到预防与控制猪群疾病的目的。本次疫情的发生，就可能是猪繁殖与呼吸综合征免疫的失败而造成的。

猪繁殖与呼吸综合征是一种免疫抑制性传染病，机体感染后可导致免疫力严重下降；另外12月底外界气温低，为保暖起见猪场减少了猪舍与外界空气对流的措施，猪舍内空气不流通再加上卫生防疫管理差和饲养密度过大，保育猪抵抗力低；再者经过了解该猪场育肥猪35日龄免疫一次猪伪狂病疫苗，母猪产前25 d免疫一次猪伪狂犬病疫苗，由于该猪场未能进行合理次数的免疫，导致猪体抗体低下，导致本次伪狂犬病的发生。

本次对发病猪群进行了诊断，诊断为HP-PRRSV和PRV混合感染，并成功分离到一株高致病性PRRSV毒株，为PRRSV的研究提供了试验材料。

[1] 童光志,周艳君,郝晓芳,等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J].中国预防兽医学报,2007,29(5):323-327.

[2] 薛平,曲向阳.我国高致病性蓝耳病研究进展[J].安徽农业科学,2014,42(5):1389-1392.

[3] 周绪斌.盘点2010——中国规模化猪场主要猪病的现状与分析[J].猪业科学,2011,28(1):50-54.

[4] 马沛,王和平.猪伪狂犬病的流行情况及净化对策[J].湖南畜牧兽医,2013(4):23-25．

[5] 胡守萍,张卓,蔡雪辉，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗和变异株灭活疫苗的免疫效果评价[J].中国预防兽医学报,2009,31(5):392-396.

[6] KRITAS S K,ALEXOPOULOS C,KYRIAKIS C S,et al.Performance of fattening pigs in a farm infected with both PRRSV and PCV type 2 following sow and piglet vaccination with an attenuated PRRS vaccine[J].Journal of Veterinary Medicine,2007,54(6):287-291.

[7] 杨汉春.2014年猪病流行情况与2015年流行趋势及防控对策[J].猪业科学,2015,32 (2):38-40.

[8] 周磊,杨汉春,姜平，等.猪繁殖与呼吸综合征防控技术与应用[J].中国畜牧杂志,2015,51(6):62-67.

2016-05-17）

河南省科技攻关项目（162102110034）。

连慧香（1978-），女，讲师，硕士研究生，研究方向为动物健康生产与疫病防治。