一种鉴别猪伪狂犬母源抗体与野毒感染的检测方法的建立

(江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏省农科院动物疫病诊断检测中心，江苏 南京 210014)

案例分析

一种鉴别猪伪狂犬母源抗体与野毒感染的检测方法的建立

孙华伟，张敬峰，赵永前，张晓曦

(江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏省农科院动物疫病诊断检测中心，江苏 南京 210014)

为探索一种鉴别16周龄以内仔猪伪狂犬野毒感染与母源抗体的ELISA检测方法，本研究通过对江苏省农科院动物疫病诊断检测中心临床门诊2016年5月份接诊的11头16周龄以内仔猪同时进行PRV-gpl抗体检测，PCR检测和PRV-gb抗体的检测，结果该11头猪的PRV-gpl抗体阳性率为100%，PCR检测阳性率为54.5%（6/11)，同时对上述11份血清进行1∶40稀释后检测PRV-gb抗体，结果PRV-gb抗体阳性率为54.5%（6/11)，且PRV-gb抗体阳性猪只与PCR检测阳性猪只的符合率为100%。本检测方法的最大发现在于相同PRV-gb抗体水平的PRV感染仔猪与来自于母源抗体仔猪的血清在经相同倍数的稀释后，PRV-gb抗体阳性率不同。随着血清稀释倍数的不断增大，PRV野毒感染猪只血清PRV-gb抗体下降的速度明显较来自于母源抗体猪只的下降速度慢。并最终确定将血清1∶40稀释为鉴别诊断的最佳稀释倍数。虽然本次检测的样本量只有11份，但是100%的符合率仍具有较高的参考价值，为江苏省乃至全国伪狂犬病的诊断与防控提供了有效数据参考，具有推广价值。

猪伪狂犬病；母源抗体；野毒感染；鉴别；检测方法

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(PRV)感染引起的以发热、脑脊髓炎为典型症状，且严重危害全球养猪业的一类传染病[1]。据中国期刊网从1990年到2000年10年间收录的文献，该病的报道仅为166篇，2001年到2011年10年间该病的文献报道为1 165篇，但2012年到2015年3年间该病的文献报道就多达783篇；其涉及范围包括了我国大部分省市，且大多数为该病的诊断与治疗及流行病学方面的文献，表明2012年后该病发病多、范围广、对养猪业危害十分巨大[2]。PRV-gpl抗体检测试剂盒虽然能够用来进行PR野毒抗体的检测，但由于PR的母源抗体最长可以维持到16周[3]。因此对gpl检测结果为阳性的16周龄以内的仔猪尚不能确定其抗体是来自于母源抗体还是猪只自身感染了伪狂犬野毒。本实验通过对临床接诊16周龄以内仔猪同时进行PCR检测，PRV-gpl抗体检测和PRV-gb抗体的检测，以探索其中的规律，具体报告如下：

1 材料与方法

1．1 材料

来自江苏省农科院动物疫病诊断检测中心临床门诊2016年5月份现场剖杀的11头16周龄以内仔猪。上述检测于2016年5月在江苏省农科院兽医所动物疫病诊断检测中心实验室进行。

1．2 主要试剂及仪器

PRV-gpl抗体检测试剂盒和PRV-gb抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司；基因组提取及PCR试剂盒等购自上海Sangon公司；酶标仪型号为宝特ExL800，美国宝特公司生产；冷冻离心机型号为Centrifuge5424R，产自德国；各种规格移液器，购自德国Eppendorf公司；恒温箱水浴锅等。

1．3 方法

PRV-gpl抗体检测，PRV-gb抗体检测及PCR检测严格按照试剂盒说明书进行相关操作[美国IDEXX公司生产的PRV-gpl抗体检测试剂盒和PRV-gb抗体检测试剂盒的说明书中规定：血清2倍稀释（1∶2）]。结果判定: PRV-gpl抗体检测试剂盒和PRV-gb抗体检测试剂盒的判断标准均为：被检样品 S/N＞0.70，样品判为阴性；被检样品 S/N≤0.60，样品判为阳性；0.60＜S/N≤0.70，样品判为可疑。

2 结果与分析

2．1 血清PRV-gpl抗体检测结果

11头16周龄以内仔猪血清的PRV-gpl抗体结果见表1。

表1 PRV-gpl抗体检测结果

图1 PRV-PCR阳性猪只血清不同稀释倍数的PRV-gb抗体

图2 PRV-PCR阴性猪只血清不同稀释倍数的PRV-gb抗体

由表1可知：11头现场剖杀的16周龄以内仔猪的PRV-gpl抗体结果均为阳性，但由于16周龄以内仔猪尚存在母源抗体，因此不能确定是仔猪自身感染了伪狂犬野毒还是来自于母源抗体。碰巧本次检测的11份样品均为PRV-gpl抗体阳性，如果检测结果为PRV-gpl抗体阴性，说明检测猪只未感染伪狂犬野毒，可以直接进行诊断。

2．2 病料PRV PCR检测结果

11头16周龄以内仔猪的脑组织PCR检测结果见表2。

表2 病料PRV PCR检测结果

由表2可知：上述11头仔猪有6头PCR检测结果为阳性，阳性率为54.5%（6/11），即超过一半的临床门诊接诊猪只存在PRV野毒感染。

2．3 血清40倍稀释PRV-gb抗体检测结果

11头16周龄以内仔猪的血清按1∶40稀释后的PRV-gb抗体检测结果见表3。

表3 血清1∶40稀释PRV-gb抗体检测结果

由表3可知：现场剖杀的11头16周龄以内仔猪的血清按1∶40稀释后的PRV-gb抗体阳性率为54.5%（6/11），且该检测结果与PCR检测结果完全一致，符合率为100%。

2．3 血清不同稀释倍数的PRV-gb抗体检测结果

11头16周龄以内仔猪的血清按不同倍数稀释后的PRV-gb抗体检测结果见表4、图1和图2。

表4 血清不同倍数稀释PRV-gb抗体检测结果

由表4、图1和图2可知：所有检测猪只的血清随着稀释倍数的不断增大，PRV-gb抗体水平都逐渐降低，但PRV-PCR阳性猪只血清PRV-gb抗体下降的速度明显较PRV-PCR阴性猪只慢。当将血清1∶2和1∶10稀释时，所有检测猪只均为PRV-gb抗体阳性，当将血清1∶20稀释时，PRV-PCR阴性猪有60%为PRV-gb抗体阳性，PRV-PCR阳性猪均为PRV-gb抗体阳性，当将血清1∶40稀释时PRV-PCR阴性猪均为PRV-gb抗体阴性，PRV-PCR阳性猪均为PRV-gb抗体阳性，与该11头猪脑组织的PCR检测结果完全一致，符合率为100%。当将血清1∶80稀释时PRV-PCR阴性猪均为PRV-gb抗体阴性，PRV-PCR阳性猪有40%为PRV-gb抗体阳性。通过对检测猪只血清进行不同倍数稀释后的PRV-gb抗体阳性率可以看出，当将血清1∶40稀释时，与检测猪只的PRV-PCR的检测结果完全符合。

虽然本次检测的样本量只有11份，但是6份PRV-PCR阳性猪只和5份PRV-PCR阴性猪只与对应PRV-gb抗体阴阳性的符合率均为100%，仍具有较高的参考价值。当然随着样本量的不断扩大，符合率会有所下降，但在猪场实际生产中检测抗体比检测病原容易，所以可以只进行相应的抗体检测，就可较为准确地鉴别16周龄以内仔猪是否感染了伪狂犬野毒。

3 讨论

本检测方法的最大发现在于相同PRV-gb抗体水平的PRV感染仔猪与来自于母源抗体仔猪的血清在经相同倍数的稀释后，PRV-gb抗体阳性率不同。随着血清稀释倍数的不断增大，PRV野毒感染猪只血清PRV-gb抗体下降的速度明显较来自于母源抗体猪只的下降速度慢。同时，PRV病原检测困难，PRV感染猪几乎不形成病毒血症，因此在血液中检出PRV的概率很低，同时PRV基因组GC含量达70%以上，设计检测病毒的PRV引物难度较大[4]。因此，如果能够对常规的ELISA检测方法进行摸索、创新和改进，将会是对目前检测方法非常有益的补充。

[1] 斯劳特．猪病学：第10版[M]．赵德明，张仲秋，沈建忠，译．8版．北京：中国农业大学出版社，2000.

[2] 孙华伟，赵永前，张敬峰，等．猪伪狂犬病的净化策略[J]．猪业科学，2016，33（1）：59-61．

[3] Yu XIU LING，ZHOU ZHI，HU DONG MEI，et al．Pathogenic Pseudorabies Virus，China，2012[J]．Emerg Infect Dis，2014，20：l02-104．

[4] 陈弟诗．猪乙型脑炎病毒-细小病毒-伪狂犬病毒活载体疫苗的研究[D]．雅安：四川农业大学，2011.

2016-07-06)

江苏省农业科技自主创新资金 【编号：CX(13)3075】

孙华伟（1981- ），男，江苏南京人，硕士，助理研究员，执业兽医师，主要从事猪病的临床诊断及重大疾病流行规律、诊断、监测和控制技术研究。E-mail：sunhuawei66@163.com