环介导等温扩增技术及其在猪病病原检测中的应用研究进展

2016-06-05

猪业科学 2016年7期

（山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600）

于新友，李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600）

环介导等温扩增(LAMP)技术是一门新兴的分子生物学检测技术，因其具有特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便和成本低等特点，越来越受到兽医相关工作者的关注。目前，该方法己被广泛应用各种猪病病原的检测。通过综述LAMP 技术在猪传染病检测中的应用研究进展情况，以期为今后猪病的诊断和防控工作提供参考。

LAMP技术；猪病；病原；检测；应用

猪传染病对养猪业的威胁时刻存在，目前养殖场主要是将病料送专业检测实验室进行病原分离鉴定或PCR检测，一旦出现疫情，由于条件所限，很难实现对疫病的快速检测。日本学者Notomi 等[1]开发了一种新型核酸扩增技术，即环介导等温扩增 (loopmediated isothermal amplification，LAMP) 技术，该技术不需要模板的热变性[2]、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程，整个反应在恒温条件下进行，反应结束后，结果可用肉眼直接观察[3]，在疫病诊断领域显示了广阔的应用前景，本文就LAMP技术及其在猪病病原检测中的应用研究进展综述如下。

1 LAMP技术

1．1 LAMP扩增原理

LAMP技术是针对靶基因6个区域设计4条特殊引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在65 ℃左右温度下，启动循环链置换反应，完成对目标DNA的大量扩增。在LAMP反应中，内引物杂交在目标DNA区，启动互补链合成，导致哑铃状DNA产生。这种结构很快以自身为板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，然后以此结构作为LAMP循环的起始结构。由于内引物杂交在茎-环的环上，引物链置换合成的DNA产生一个有缺口的茎-环DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。

图1 LAMP的引物组成及对应区域

1．2 LAMP引物设计

首先在靶基因的3’末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5’末端设定B1、B2、B3三个区段。针对这6个区段设计4条引物，包括一对内部引物和一对外部引物。上游内部引物FIP：在3’末端含有与F2c互补的F2区段，在5’末端含有与F1c相同序列的区段下游内部引物BIP：在3’末端含有与B2c互补的B2区段，在5’末端含有与B1c相同序列的区段。上游外部引物F3：含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。下游外部引物B3：含有与目标DNA的B3相同序列的区段，各引物组成及对应区域如图1所示。引物的设计要注意以下几个问题：1）扩增领域为F2-B2区段间，应该在200 bp以内；2）包含F2/B2在内的环状部分的长度在40～60 bp范围内；3）各区段的Tm值应该在60～65 ℃之间；4）若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零；5）引物应避免二次结构发生；6）各引物的3’端不可含有与其他引物互补的序列。

1．3 LAMP技术特点

LAMP技术特点具有以下特点：1）操作简便、耗时短、成本低，扩增反应在等温下持续进行，只需在恒温水浴锅中几十分钟即可完成，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性，适合在基层养殖场的推广应用；2）扩增的效率高，没有PCR反应中温模板的退火、复性过程，在15～60 min内可扩增109～1010倍，能满足临床病料样本快速检测的需要；3）特异性高，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。针对6个区段使用4种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列；4）灵敏度高，检测的敏感性是常规PCR的10倍，扩增模板可达10拷贝或更少；5）仅使用一种链置换型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一种不耐热的DNA聚合酶，因此必须在模板预变性以后再加样；6）扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构；7）当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。

1．4 反应产物的检测

LAMP反应产物的检测方法主要有5种：1）以2%的琼脂糖凝胶电泳观察是否有典型的梯状条带泳判定结果；2）以扩增产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生用肉眼直接判断扩增反应是否进行；3）反应体系中加入溴化乙锭、SYBR Green Ⅰ等染料，通过观察扩增结果是否产生相应颜色来判定是否有目的片段扩增；4）通过恒温扩增微流控芯片实时观察反应结果；5）运用实时浊度仪监测反应结果。

2 在猪细菌病检测中的应用

2．1 猪霍乱沙门氏菌检测

猪霍乱沙门氏菌是引起猪沙门氏菌病的主要血清型，主要感染断奶期仔猪，引发仔猪副伤寒，临床上以急性败血症、慢性坏死性肠炎、顽固性下痢等为特征，当并发或继发感染其他疾病或治疗不及时时，死亡率较高，给养猪业造成重大的经济损失，严重困扰着养猪业的健康发展。时建立等[4]根据猪霍乱沙门氏菌lacZ基因设计特异性引物，通过优化各种反应条件，建立了检测猪霍乱沙门氏菌的LAMP快速检测方法，该法特异性好，灵敏度高，将细菌DNA稀释到10-8仍可检出，是PCR方法的1 000倍。

2．2 猪链球菌血清2型检测

猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌，它能引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，各年龄段猪均可感染猪链球菌病，但以3～12周龄猪，尤其断奶仔猪最易感[5]，该病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重要疫病[6]。张九州等[7]根据GenBank登录的猪链球菌2型特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标，在其序列的保守区域设计LAMP引物，利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增，优化了LAMP的反应条件和反应体系，并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示，该法对SS2进行扩增，扩增产物显色呈现阳性反应，电泳出现阶梯状条带，最低检测量为0.186fg/μL模板DNA，比常规PCR高1 000倍，且与其他常见的细菌无交叉反应。

2．3 副猪嗜血杆菌检测

副猪嗜血杆菌(Hps)可引起猪的副猪嗜血杆菌病，该病以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征。近几年来，世界各地均有发生副猪嗜血杆菌病的报道，并且发病率呈上升的趋势，已经成为一个全球性的重要猪病[8]。随着我国规模化养猪业的不断发展，该病发生呈加速流行趋势并成为多病原呼吸道疾病综合征中的重要一员，危害日渐严重，对养猪业造成了巨大的经济损失。车勇良等[9]建立了Hps可视化LAMP检测方法，在55 ℃水浴1h即可对Hps核酸进行高效扩增，反应结束后加入SYBR Green Ⅰ即可通过肉眼观察对结果进行判断。该方法具有很强的特异性，其对DNA核酸的最低检测限为40fg，是常规PCR检测最低限的100倍，显示出较高的敏感性。

2．4 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检测

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)作为猪传染性胸膜肺炎的病原菌，可引起严重的传染性呼吸道疾病，该病具有高发病率和致死率，广泛分布于中国、美国、日本等全世界所有养猪的国家，主要感染生长肥育猪，可引起发烧、腹泻以及严重的呼吸窘迫。刘亚娟等[10]根据APP ApxIVA基因的保守区设计6条-LAMP引物，建立了APP的 LAMP方法。结果显示，该法在64 ℃下反应15 min DNA即可出现扩增，扩增后2～3 min内即可判定结果，最低检测限为0.307 ng/L，具有良好的重复性及稳定性，与其他病原菌无交叉反应，同时，试验结果可实现肉眼可视化观察。

2．5 猪多杀性巴氏杆菌检测

猪多杀性巴氏杆菌(Pm)为猪呼吸道综合征的主要病原之一，可原发或继发猪呼吸道综合征，降低饲料利用率，严重影响养猪业的经济效益。孙建华等[11]根据猪多杀性巴氏杆菌Plp B基因序列为靶基因设计特异性引物，建立了猪Pm特异性的LAMP快速检测方法。经反应条件优化，确定反应条件为63 ℃、20 min。检测结果显示，建立的LAMP检测方法具有良好的特异性，灵敏度为25 cfu/mL，与大肠杆菌、Hps、APP、沙门氏菌无任何交叉反应。

2．6 金黄色葡萄球菌检测

金黄色葡萄球菌感染可造成猪的急性、亚急性或慢性乳腺炎，坏死性葡萄球菌皮炎及乳房的脓疱病。蔡克周等[12]以金黄色葡萄球菌(CMCC10201)的femA基因作为靶序列，设计LAMP和PCR引物，通过凝胶电泳，判断检测结果。对8株常见致病菌进行LAMP特异性实验，表明对金黄色葡萄球菌的检测具有很高的特异性，LAMP检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为8.7 CFU/ mL，直接检测猪血中金黄色葡萄球菌的检出限为8.7×102CFU/mL，PCR法的检出限为8.7×103CFU/mL。

3 在猪病毒病检测中的应用

3．1 猪瘟病毒检测

猪瘟是黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病，在世界范围内广泛流行，其发病率和死亡率均高，对养猪业危害十分严重[13]。张改平等[14]比较分析了CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异，设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的LAMP引物，建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法。该方法特异性好，比RT-PCR灵敏度高出1 000倍，且重复性稳定性良好，为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法。郑新添等[15]针对CSFV的NS3基因设计LAMP引物，建立了快速检测CSFV的LAMP方法，并对LAMP反应体系、反应条件进行优化，评定其特异性和敏感性。结果表明：该方法可在65 ℃、50 min内快速扩增CSFV，扩增结果可通过可视的颜色判断，LAMP反应对猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒等无交叉反应，其检测CSFV的最低浓度为13.6 fg/μL，对临床样品的检出率高于RT-PCR技术。

3．2 猪繁殖与呼吸综合征病毒检测

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种接触性传染病，各日龄猪均可感染，临床上主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸症状。PRRSV具有高度传染性，既能垂直传播又能水平传播，在世界各国蔓延，造成重大的经济损失，引起了各国政府的高度重视。蒲静等[16]针对PRRSV美洲型ORF6基因的6个区域，利用2对引物建立检测PRRSV的RTLAMP快速检测方法，该方法具有高灵敏度，高特异性的优点，在2 h左右即可得出结果，其灵敏度与PRRSV荧光RT-PCR检测方法相近，高于普通RT-PCR检测方法。将灭活的PRRSV美洲型培养物作10倍系列稀释，结果显示建立的荧光RT-PCR的检测极限可达10-7，RT-PCR检测方法的检测极限为10-5，RT-LAMP检测方法达到10-8。罗忠永等[17]根据PRRSVM蛋白基因保守区设计的LAMP引物，建立了PRRSV的快速检测方法，结果表明，该法能在64.5 ℃、60 min内实现对目标核酸片段的大量扩增，检测结果可通过直接观察反应副产物(焦磷酸镁)进行判读，该检测系统具有很高的特异性，与CSFV、猪乙型脑炎病毒等均无交叉反应，通过PRRSV不同毒株疫苗、模拟样品和临床样品确定，该检测系统具有很好的稳定性，通过质粒确定该检测系统可以检测到10拷贝/μL的病毒核酸模板。

3．3 猪伪狂犬病病毒检测

猪伪狂犬病病毒(PRV)主要引起母猪繁殖障碍、流产、产木乃伊胎、死胎和产弱仔，初生仔猪表现为腹泻及神经症状，感染率和死亡率可达100%，给养猪业造成了严重的经济损失。张莉等[18]针对PRVgE基因保守区域设计并合成了4条引物，建立了PRV的环介导等温扩增检测方法，并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示，该方法可特异性地检测PRV强毒株，不能检测PRRSV、猪细小病毒、CSFV、猪流感病毒和PRVgE基因缺失疫苗株，该方法的最低检测量可达100个拷贝质粒DNA，比常规PCR方法的敏感性高10倍。王树芬等[19]设计并合成3对LAMP引物，以罗丹明B衍生物作指示剂(该指示剂在反应前加到反应缓冲液里)，通过优化反应条件，建立了可视化LAMP快速检测PRV的方法，该法在63 ℃恒温反应40 min可得到肉眼可视结果，颜色变成蓝色判定为阳性，仍然保持紫色判定为阴性。

3．4 猪圆环病毒2型检测

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征的主要病原，此外，PCV2还与猪呼吸道综合征、猪皮炎与肾炎综合征和繁殖障碍以及肠炎等疾病有关，是一种免疫抑制性疾病，给世界养猪业造成严重的经济损失。杨泽晓等[20]建立了快速检测PCV2的LAMP方法，在64 ℃、45 min条件下可扩增出大于1 345 bp的特异性梯状DNA条带，检测限度可达10 拷贝/μL，用它对PCV1、PPV、PRV、PRRSV和CSFV的核酸进行扩增，但结果均为阴性。用建立的LAMP方法进行的样品检测结果显示，6株受检PCV2毒株的检出率为100%，60份临床检样PCV2的阳性率为20%(12/60），与PCR方法平行检测的结果相一致。胡瑞丽等[21]根据PCV2的ORF2基因设计出3对特异性引物，扩增PCV2基因的最佳温度和时间优化到59 ℃孵育55 min。用该方法对临床样品进行检测，LAMP检测对PCV2的检测限为10拷贝/μL，而常规PCR检测法的检测限为1 000拷贝/μL，表明LAMP检测法灵敏度高。该检测法不会与猪圆环病毒Ⅰ型、PRRSV、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和轮状病毒发生交叉反应。

3．5 PPV检测

猪细小病毒(PPV)可引起母猪发生流产、产死胎、产畸形胎、胎儿木乃伊化和不孕等，初产母猪受到的危害最为严重。刘业兵等[22]据GenBank公布的PPV序列，在其保守序列区域设计了多套LAMP引物，建立了对PPV LAMP检测方法，结果显示，该法在63 ℃恒温下作用45 min，PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增，其检出限量为0.23TCID50，敏感性高，在反应结束后加入SYBR Green I以肉眼判断结果，与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。陈星瑶等[23]建立了快速检测PPV的LAMP方法，通过优化反应条件，扩增的温度60 ℃、62 ℃、64 ℃和66 ℃均可以，最佳扩增时间为45 min，最低可检测10拷贝的PPV核酸模板量，特异性良好，对SS2、猪水泡病病毒、PRV、CSFV、猪流感病毒、O型口蹄疫病毒、PRRSV和水扩增结果均为阴性，不需要电泳检测反应结果，只需向产物管内加SYBR Green Ⅰ荧光染料，肉眼观察，阳性反应管颜色立刻变为黄绿色，且模板浓度不同颜色有深浅变化，结果容易判定，适于临床推广。

3．6 猪乙型脑炎病毒检测

乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种人畜共患的自然疫源性传染病，JEV主要通过蚊虫叮咬传播，猪是其主要传染来源和扩散宿主，可导致妊娠母猪流产、产死胎或弱仔，公猪睾丸炎，育肥猪持续高热，新生仔猪呈神经症状等，给养猪业造成巨大的经济损失。卢冰霞等[24]根据猪JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物，以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增，并对反应条件和反应体系进行了优化。结果显示该方法具有较高的灵敏度，其检测极限为0.5 pg，特异性试验表明其具有较高的特异性，对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比，2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察，大大缩短了检测时间。周玉鹏等[25]根据Gen Bank中登录的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV毒株基因序列，分别设计了1套基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物，并以此引物分别建立了基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RTLAMP方法。结果显示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法均能在1 h内完成对相应基因型JEV的RNA扩增，并与CSFV、PRRSV、PCV2、PPV和PRV无交叉反应。灵敏性试验结果显示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特异性RT-LAMP方法均能扩增出24拷贝的JEV RNA。

3．7 猪流行性腹泻病毒检测

猪流行性腹泻病毒 (PEDV)可感染猪而导致猪流行性腹泻，该病的主要特征是猪呕吐、脱水和水样腹泻，是一种高度接触性肠道传染病，多发生于冬、春季节，但夏季也可发病。该病最初于发生在英国，随后世界各地均有相关报道，我国于1976年最初报道该病。各日龄的猪均可感染PEDV发病，其中哺乳仔猪受到的危害最严重，给养猪业造成了巨大的经济损失。Gou等[26]建立了PEDV的LAMP检测方法，该方法在62℃水浴条件下，40 min即可完成反应，结果显示，该法最低可检测10 pg的RNA量，该法特异性好，对常见猪病毒的扩增结果均为阴性，且不与其他常见猪病毒核酸发生交叉反应。汤小真等[27]针对PEDV的NP基因设计1套LAMP引物，在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂代替传统的反应后添加SYBR GreenⅠ染料，建立了基于钙黄绿素的可视化LAMP检测PEDV的方法。该方法能在65℃、1 h内特异性扩增PEDV，与CSFV、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒及大肠杆菌等均无交叉反应，检测下限为3.73 pg/μL，其结果可用肉眼判断，快捷方便。

3．8 猪传染性胃肠炎病毒检测

传染性胃肠炎病毒(TGEV)可引起猪传染性胃肠炎，该病是一种以呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征高度传染性疾病，秋始、冬春为该病高发期。目前我国大部分地区都有该病发生流行，各种不同品种和月龄的猪都能感染TGEV发病，2周龄受到的危害最为严重，一旦感染后，其死亡率可高达100%。5周龄以上的猪感染后虽然死亡率不高，但生长缓慢，饲料利用率低，给养猪业造成了严重的经济损失。高睿泽等[28]建立针对猪TGEV N基因RT-LAMP快速检测方法，并对该检测方法的特异性与灵敏性进行了评价。该方法在63 ℃恒温下作用50 min，使猪TGEV的 N基因获得了高效率特异性扩增，与PEDV等其他猪易感病毒无交叉反应，具有很好的特异性，同时该方法具有极高的灵敏性，可检测到131.4 fg/ μL的目标病毒RNA，比普通PCR的灵敏度高3个数量级，反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化，结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。

3．9 猪流感病毒检测

猪流感病毒(SIV) 可引起猪流感，该病一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，有明显的季节性，深秋、早春和冬季多发，各种年龄、性别和品种的猪均易感，临床上主要表现为发病急、呼吸困难、咳嗽、流泪、鼻液增多、衰竭、低死亡率等。目前，已经分离到多种血清型，在我国猪群中流行较广的主要是H1N1、H1N2和H3N2。苏霞等[29]从GenBank中获得H1N1 SIV血凝素、神经氨酸酶基因序列，应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列，利用Primer ExplorerV4软件在序列保守区域设计LAMP引物，即外引物和内引物，同时以H1N1 SIV的cDNA作为阳性模板，对试验中的几个反应条件进行优化。建立H1N1 SIV LAMP快速检测方法。结果显示，该法对H1N1 SIV的灵敏度达到4～6个拷贝，其引物对于H9亚型禽流感病毒、CSFV和PCV2均无非特异性扩增，表现出良好的特异性。张莉等[30]针对SIV NP基因保守区域设计并合成6条引物，建立了SIV的LAMP检测方法，并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示，该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒，但不能检测PRRSV、PRV、CSFV、PPV、PCV2、JEV，该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。

3．10 其他病毒

LAMP技术还用于口蹄疫病毒[31]、非洲猪瘟病毒[32]、猪脑心肌炎病毒[33]和猪巨细胞病毒[34]、猪细环病毒[35]、水疱性口炎病毒[36]等多种病毒的检测，试验结果都表明LAMP是一种简便、快速、高灵敏和高特异的核酸扩增方法。

4 在猪支原体肺炎检测中的应用

猪肺炎支原体（Mhp）可引起猪支原体肺炎，该病是一种慢性呼吸道传染病，临床上以咳嗽、气喘和肺部典型的“虾肉”样变为特征，具有接触传染性高、死亡率低和诱发性强的特点。Mhp是重要的猪支原体病原之一，可导致猪地方性肺炎。不同年龄、性别、品种的猪群均可感染，以咳嗽和气喘为主要症状。李鹏[37]等根据GenBank中登录的Mhp的核苷酸序列，设计4条特异性引物，用外引物进行PCR反应，对内外引物浓度、dNTP＋和MgSO4浓度及Bst DNA聚合酶用量等进行优化，建立MhpLAMP检测方法，应用该方法检测Pm、APP、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、Hps和链球菌均呈阴性，当Mhp的拷贝数高于3时，均可检测到该病原体。

5 在猪寄生虫病检测中的应用

刚地弓形虫可引起猪弓形虫病，弓形虫通过口、眼、鼻、呼吸道、肠道及皮肤等途径侵入猪体，以高热、呼吸及神经症状及繁殖障碍为特征。王玉娇等[38]建立了猪弓形虫病LAMP检测方法，结果显示，该法在样本DNA稀释3×105倍后仍可检出，该方法扩增不出新孢子虫、瑟氏泰勒虫及猪附红细胞体等病原体DNA，表明建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点，适合于猪弓形虫病的检测。猪附红细胞体病是由猪附红细胞体寄生于猪红细胞表面或游离在血浆中引起猪的以贫血、黄疸、发热等为主要临床特征的猪附红细胞体病，该病也是一种人畜共患病。李月梅等[39]建立了猪附红细胞体的LAMP检测方法，结果显示，用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试，结果表明：利用LAMP技术成功检测到猪附红细胞体基因区，该法最低可检测5×105倍稀释的DNA量，并且特异性强，对新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫病原体检测均为阴性。

6 小结

LAMP技术作为一种快速基因扩增技术，自发明以来，在国内外疾病、卫生、食品及环境等多个领域都取得了重大成就，近年来受到了越来越多的关注，LAMP是整个过程均在恒温条件下进行，不需要昂贵仪器设备，而易在基层部门普及的检测技术，避免了常规PCR对于温度循环的特殊要求所带来的各种不便，可快速、准确地做出传染性病病原学诊断，从而及时有效控制疫情，使养殖场损失降到最低。但LAMP检测技术同样存在一些不足，一是LAMP对于引物设计要求很高，需要设计的引物数目多，结构复杂。二是检测灵敏度太高，易因空气中的气溶胶污染而产生假阳性结果。三是在LAMP扩增结果判定方面也存在一定的问题，当以琼脂糖凝胶电泳法判定结果时，结果为梯形条带，不易鉴别非特异性扩增。当焦磷酸镁白色沉淀和体系中添加染料法判定结果时，可能存在因结果颜色不明显而造成肉眼观察不便捷及误判，另外，当有非特异扩增时，染料也可结合，影响结果判定。当采用微流控芯片和实时浊度仪法判定结果时，则需要购置昂贵的分析仪器。随着研究的不断深入，研究人员还将其与原位杂交、免疫捕获、核酸杂交等技术进行联合，开发了很多有效的检测方法，尤其是将环介导等温扩增与横向流动试纸条技术结合，发展起来的新的将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用，建立一种新的病原快速检测技术，即LAMP-LFD技术。使得LAMP现场检测结果的观察更加方便、直观和准确。并解决了扩增产物形成气溶胶污染环境，导致样品间交叉污染的问题，开启了基因检测技术步入了基层养殖场的应用新时代，极具推广前景。目前已经有科研人员在CSFV的检测方面[40]进行了一些探索，并取得了一定的成绩，笔者认为LAMP-LFD技术是未来LAMP检测技术将来的发展的方向，在一些基层实验室和流行病学调查等领域具有广阔的应用前景。

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