Zn和EDTA对紫花苜蓿叶片光合特性的响应

代惠萍,赵　桦,贾根良,冯佰利

(1.陕西理工学院,陕西省资源重点实验室,陕西 汉中　723001;2.陕西理工学院 生物科学与工程学院,陕西 汉中　723001;3.兰州大学 生命科学学院,甘肃省环境生物监测与修复重点实验室,甘肃 兰州　730000;4.西北农林科技大学 理学院,

陕西 杨凌　712100;5.西北农林科技大学,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西 杨凌　712100)



Zn和EDTA对紫花苜蓿叶片光合特性的响应

代惠萍1,2,3,赵桦2,贾根良4,冯佰利5

(1.陕西理工学院,陕西省资源重点实验室,陕西 汉中723001;2.陕西理工学院 生物科学与工程学院,陕西 汉中723001;3.兰州大学 生命科学学院,甘肃省环境生物监测与修复重点实验室,甘肃 兰州730000;4.西北农林科技大学 理学院,

陕西 杨凌712100;5.西北农林科技大学,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西 杨凌712100)

摘要：为了探索提高紫花苜蓿的抗锌能力,以3个紫花苜蓿品种为试材,采用土培法,研究Zn胁迫(250 μg/kg)下,EDTA对不同品种紫花苜蓿叶片锌富集量、光合色素含量及叶绿素荧光参数的影响。结果表明,在50 d时,紫花苜蓿叶片Zn的含量均显著增高,Zn+EDTA显著提高了苜蓿叶片对锌的吸收;大叶苜蓿品种叶片光合色素的含量高于对照,大叶苜蓿叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素的含量显著高于其他2个品种;EDTA处理可提高大叶苜蓿初始荧光值、可变荧光、最大荧光值、最大光化学效率的水平。结果显示,EDTA促进大叶苜蓿叶片的光合色素含量的增加,减少过剩激发能的耗散,提高光合电子传递效率,有效降低锌胁迫对紫花苜蓿叶片PSⅡ的伤害,提高大叶苜蓿的抗锌能力。

关键词：锌;EDTA;紫花苜蓿;叶绿素;叶绿荧光

随着工业发展进程的加快,采矿、“三废”等带来的重金属对土壤的污染日趋严重[1-3]。尤其是土壤锌污染对生态环境和人体健康造成的危害,备受人们关注[4]。植物修复是治理土壤重金属污染常用技术,具有治理成本的低廉性、治理过程的原位性以及治理效果的永久性等特点[5-6]。施加螯合剂可以促进土壤固相中重金属的释放,提高重金属的生物有效性[7-13]。Liu 等[14]研究发现,EDTA 的添加使金盏菊土壤Cd 的修复效率提高了217%。Cui 等[15]研究表明,施加螯合剂EDTA后植物中Pb 的累积浓度增加了2.5倍。张敬锁等[16]报道,在土壤中添加EDTA,并不能增加水稻和小麦对Cd 的吸收,反而有所降低。关于EDTA螯合剂对土壤金属元素溶解和植物吸收是促进还是抑制,目前尚存在争议。

紫花苜蓿不仅是食品、饲料的重要来源,也在纺织、造纸等工业方面有着广泛的用途[4]。Dai等[4]研究证实,紫花苜蓿对Zn具有较高的富集能力,其生物量大,生长周期长,抗干旱和病虫害能力强,是一种潜在的、应用前景较好的重金属污染土壤修复植物。随着紫花苜蓿深加工的发展,污染的土壤上种植紫花苜蓿,收割后作为工业用途,避免紫花苜蓿体内的重金属进入食物链,对促进苜蓿产业健康可持续发展,保障环境安全具有重要的现实意义。本试验通过添加外源EDTA,初步探讨EDTA对Zn胁迫下紫花苜蓿叶片Zn积累量和光合色素积累的影响,解析紫花苜蓿在Zn胁迫下的生理响应与耐受机制,为螯合剂诱导植物修复Zn污染土壤提供理论依据。

1材料和方法

1.1供试材料

供试材料为大叶苜蓿(Medicagosativassp.)、维多利亚(Vitoria Alfalfa)、阿尔冈金(Medicagosativacv.)3个紫花苜蓿品种。

供试土壤为陕西理工学院生物工程学院试验地的园田土,采用园田土、草炭、蛭石,按照(3∶1∶1)的体积比充分混匀,自然风干,过2 mm 筛。然后取若干土样做本底值测试,并将其余土分装于塑料盆中。

1.2试验设计

采用盆栽法,用25 cm×16 cm塑料盆,每盆土壤质量约 2 kg,设置3个处理,6个重复,共 108盆。于2014年3月播种,选饱满、无病虫害苜蓿种子,用0.1%的HgCl2消毒10 min,每盆播种20粒,在自然光照条件下培养,出芽15 d后间苗,每盆留15株长势均匀的幼苗。植株生长期间用Hoagland营养液浇灌,苜蓿幼苗生长3个月后,向盆内加入ZnSO4·7H2O和乙二胺四乙酸(EDTA)与去离子水配成母液,两者母液均用去离子水配制，然后稀释成所需的处理浓度,试验共设置3个浓度的锌处理,即0(CK)、250 μg Zn、250 μg Zn+10 μg/kg EDTA,溶液pH值用NaOH或HCl调至6.5。并一次性施入相应的盆栽土壤中。培养期间,采用称重法,补充消耗的水分。分别在胁迫25,50 d时进行收获,选择生长基本一致的植株,每个处理收获12株,将每株叶片分开,迅速用液氮速冻,保存于-80 ℃冰箱中,进行相关指标测定。

1.3测定项目与方法

1.3.1苜蓿锌含量的测定分别在锌胁迫25,50 d时进行收获,每个处理取12株,将每株的叶片分开。叶片在80 ℃干燥48 h,粉碎成粉末,65% (m/V)HNO3消解,用原子吸收分光度计测定Zn含量[4]。

1.3.2叶绿素荧光参数的测定采用美国OPTI-sciences公司脉冲调制式叶绿素荧光仪(OS-30p,USA)测定,选择成熟功能叶进行荧光参数测定。测量前,于7:00和12:00黑布遮光暗适应20 min,记录紫花苜蓿叶片暗适应下的初始荧光值(Fo)和最大荧光值(Fm),并据此计算可变荧光和光系统Ⅱ(PSⅡ)的最大光化学效率(Fv/Fm)[16]。

1.3.3光合色素含量的测定将叶片剪碎混匀,80%(m/V)丙酮浸提法[17]。叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量参照Dai等[18]方法计算。

1.4数据分析

采用统计软件SPSS 12进行统计分析。One-Way ANOVA方差分析比较不同处理间各项指标的差异,通过LSD法进行差异显著性(P<0.05)分析。

2结果与分析

2.1EDTA对锌胁迫下紫花苜蓿叶片锌含量的影响

图1可见,单一Zn胁迫条件下,随着胁迫时间延长,参试紫花苜蓿叶片Zn含量呈增加趋势,且Zn+EDTA复合处理下苜蓿叶片锌含量有不同程度增加。在25 d时,Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫组分别增加了24.8%,14.1%,35.6%(P<0.05),在第50天时,Zn+EDTA复合处理紫花苜蓿叶片Zn的含量分别比单一Zn胁迫提高了7.0%,26.9%(P<0.05),2.5%(P>0.05)。

数据显示为平均值±SE(n=6)。同一品种和同一处理不同时间的不同字母表示差异达0.05显著水平(新复极差法)。图2同。

2.2EDTA对锌胁迫下紫花苜蓿叶片光合色素含量的影响

图2-A、B显示,单一Zn胁迫条件下,随着胁迫时间延长,参试紫花苜蓿叶片Chl a和Chl b含量总体呈增加趋势,且Zn+EDTA复合处理下苜蓿叶片Chl a和Chl b含量大部分增加。在25 d时,Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫Chl a和Chl b含量增加了7.2%和18.1%(大叶苜蓿)、6.5%和15.3%(阿尔冈金苜蓿)、1.5%(维多利亚苜蓿),而维多利亚苜蓿叶片Chl b含量降低了15.7%(P<0.05)。在50 d时,复合处理紫花苜蓿叶片Chl a和Chl b含量分别比单一Zn胁迫显著提高了12.7%和11.8%(大叶苜蓿)，阿尔冈金苜蓿Chl a含量增加了4.6%，维多利亚Chl b含量增加了11.9%，而维多利亚苜蓿叶片Chl a含量降低了13.1%,阿尔冈金苜蓿叶片Chl b含量降低了8.9%(P<0.05)。表明EDTA显著提高了大叶苜蓿叶片Chl a和Chl b积累的量。

图2-C、D中所示,单一Zn胁迫条件下,随着胁迫时间延长,参试紫花苜蓿叶片总叶绿素(Chl a+b)和类胡萝卜素(Car)含量总体呈增加趋势,且Zn+EDTA复合处理下苜蓿叶片Chl a+b和Car含量有不同程度增加。在25 d时,Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫Chl a+b和Car含量增加了9.2%和11.8%(大叶苜蓿)、4.9%和10.7%(阿尔冈金苜蓿)、维多利亚苜蓿Car 增加了10.7%，而Chla+b降低了3.5%(P<0.05)。50 d时,复合处理紫花苜蓿叶片Chl a+b和Car含量分别比单一Zn胁迫显著提高了12.5%和14.8%(大叶苜蓿)、1.2%和2.6%(阿尔冈金苜蓿),而维多利亚紫花苜蓿叶片Chla+b增加了0.4%，而Car含量降低了15.9%(P<0.05)。随着胁迫时间延长,表明EDTA显著提高了大叶苜蓿叶片Chl a+b和Car积累的量,进而有效地促进了Zn胁迫对光合色素合成。

2.3EDTA对锌胁迫下叶绿素荧光参数的影响

由表1可知，不同处理对紫花苜蓿叶片Fo、Fv、Fm和Fv/Fm值的影响，在25 d时，单一Zn胁迫条件下，参试品种阿尔冈金与大叶苜蓿叶片Fo、Fv和Fm均呈上升趋势，维多利叶片Fo呈逐渐增加趋势，而Fv和Fm呈下降趋势。Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫Fo、Fm和Fv值增加了6.0%3.6%和2.8%(大叶苜蓿)，阿尔冈金Fm和Fv值增加了3.5%和16.2%，而Fo值降低了2.1%，且维多利亚Fo、Fm和Fv值降低了35.3%，38.3%，39.2%，Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫Fv/Fm值降低了1.3%和1.3%(大叶苜蓿和维多利亚)，而阿尔冈金叶片Fv/Fm增加了4.1%。在50 d时，Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫Fo、Fm、Fv和Fv/Fm值增加了5.4%，14.9%，18.1%，4.0%(大叶苜蓿)，阿尔冈金和维多利亚叶片Fo、Fm、Fv和Fv/Fm值分别降低了37.9%，37.7%，37.6%，0和31.6%，41.8%，44.8%，5.2%。

图2　EDTA对锌胁迫下紫花苜蓿叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量的影响

时间/dTime品种Cultivars浓度ConcentrationFoFmFvFv/Fm25阿尔冈金CK303±3.5d1182±8.9e879±7.5gh0.74±0.08cZn335±7.1a1238±16.0de898±8.2g0.73±0.01cZn+EDTA328±6.7b1372±12.6b1044±7.3b0.76±0.03ab大叶苜蓿CK278±11.2f1277±11.1d999±8.9ef0.78±0.03aZn296±5.2e1279±13.5d983±8.1f0.77±0.04abZn+EDTA314±4.6c1325±13.6c1011±8.3e0.76±0.05ab维多利亚CK299±5.2de1410±9.1a1111±7.6a0.79±0.02aZn309±2.9d1396±11.2ab1087±5.8a0.78±0.05a

表1(续)

注:数据显示为平均值±SE(n=6)。同一品种不同字母表示在0.05水平有显著差异;*.P≤0.05;**.P≤0.01;ns.不显著。

Note:Data indicate means±SE(n=6).Different letters in same cultivars mean significant differences at 0.05 levels;*.P≤0.05;**.P≤0.01;ns.Not significant.

3讨论

EDTA能增加土壤中重金属的生物有效性,促进植物对重金属的吸收,降低重金属对土壤和植物的毒性[17,19]。添加EDTA能够使Cu、Cd、Pb和Zn在灯心草和龙须草体内的积累量显著增加[17]。本试验进一步证实,随着胁迫时间延长,在50 d时,与单一锌胁迫比较,EDTA提高了苜蓿叶片对锌的吸收,表明EDTA可以促进植物对Zn的吸收,这与王红新和邱莉萍[12,20]的研究结果相似。这可能是向土壤中施加螯合剂EDTA,活化了土壤中的重金属,提高重金属的生物有效性,促进植物吸收。

叶绿素是植物进行光合作用的重要物质,其含量的多少是衡量叶片生长状况的重要指标[17]。王学锋等[21]研究表明,EDTA的添加促进了茼蒿的生长,使茼蒿中的叶绿素含量增加。在本试验中也验证了这一点。在50 d后,Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫组苜蓿叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量呈不同程度增加趋势。与不同品种相比较,大叶苜蓿叶片绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量显著高于维多利亚和阿尔冈金。说明EDTA的添加对苜蓿未产生毒害且使土壤中Zn受EDTA络合,更易被苜蓿吸收,而Zn对叶绿素合成有重要的影响。

叶绿素荧光动力学技术在探测逆境对光合作用影响方面具有独特的作用,能够反映光合系统“内在性”特点[18,22]。其Fv/Fm值作为叶绿素荧光重要指标之一,通常在胁迫条件下此指标降低程度表明PSⅡ遭受到破坏程度。单一Zn胁迫条件下,与不同品种相比较,大叶苜蓿叶片Fo、Fv和Fm均呈逐渐上升趋势,Zn+EDTA复合处理比单一Zn胁迫组苜蓿初始荧光值、可变荧光、最大荧光值、最大光化学效率均呈不同程度增加。本研究表明,EDTA促进大叶苜蓿叶片的光合色素含量的增加,减少过剩激发能的耗散,提高光合电子传递效率,有效降低锌胁迫对紫花苜蓿叶片PSⅡ的伤害,提高大叶苜蓿的抗锌能力。

参考文献：

[1]孙宁骁,宋桂龙.紫花苜蓿对镉胁迫的生理响应及积累特性[J].草业科学,2015,32(4):581-585.

[2]Qiu Z B,Li J T,Zhang M M,et al.He-Ne laser pretreatment protects wheat seedlings against cadmium-induced oxidative stress [J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2013,8:135-141.

[3]刘大林,杨俊俏,刘兆明,等.镉、铅胁迫对草地早熟禾幼苗生理的影响[J].草业科学,2015,32(2):224-230.

[4]Dai H P,Shan C J,Zhao H,et al.The difference in antioxidant capacity of four alfalfa species in response to Zn [J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2015,114:312-317.

[5]王红新,郭绍义,胡锋,等.螯合剂对铅锌尾矿改良基质上蓖麻幼苗生长和铅锌积累的影响[J].土壤学报,2012,49(3):491-498.

[6]汪楠楠,胡珊,吴丹,等.柠檬酸和EDTA对铜污染土壤环境中吊兰生长的影响[J].生态学报,2013,33(2):631-639.

[7]Li X N,Yang Y L,Jia L Y,et al.Zinc-induced oxidative damage,antioxidant enzyme response and proline metabolism in roots and leaves of wheat plants[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2013,89(1):150-157.

[8]Luo C L,Shen Z G,Li X D.Enhanced phytoextraction of Cu,Pb,Zn and Cd with EDTA and EDDS[J].Chemosphere,2005,59(1):1-11.

[9]Seth C S,Misra V,Singh R R,et al.EDTA-enhanced Lead phytoremediation in sunflower(HelianthusannuusL.)hydroponic culture[J].Plant and Soil,2011,347(1):231-242.

[10]杨明琰,陈华,梁语燕,等.EDTA强化黑麦草对铅污染土壤的诱导修复效应[J].环境科学与技术,2014,37(9):19-22.

[11]胡亚虎,魏树和,周启星,等.螯合剂在重金属污染土壤植物修复中的应用研究进展[J].农业环境科学学报,2010,29(11):2055-2063.

[12]王红新,胡锋,许信旺,等.EDTA对铅锌尾矿改良土壤上玉米生长及铅锌累积特征的影响[J].生态学报,2011,31(23):7125-7132.

[13]蒋先军,骆永明,赵其国,等.镉污染土壤植物修复的EDTA调控机理[J].土壤学报,2003,40(2):205-209.

[14]Liu J,Zhou Q X,Wang S.Evaluation of chemical enhancement on phytoremediation effect of Cd-Contaminated soils withCalendulaofficinalisL.[J].International Journal of Phytoremediation,2010,12(5):503-515.

[15]Cui S,Zhou Q X,Wei S H,et al.Effects of exogenous chelators on phytoavailability and toxicity of Pb inZninniaelegansJacq[J].Journal of Hazardous Materials,2007,146(1/2):341-346.

[16]张敬锁,李花粉,衣纯真,等.有机酸对活化土壤中镉和小麦吸收镉的影响[J].土壤学报,1999,36(1):61-66.

[17]孙健,铁柏清,秦普丰,等.EDTA调控下灯心草和龙须草对铅锌尾矿污染土壤的修复潜力[J].环境科学研究,2006,19(4):105-110.

[18]Dai H P,Wei Y,Yang T X,et al.Influence of photosynthesis and chlorophyll synthesis on Cd accumulation in populus×canescens[J].Journal of Food Agriculture & Environment,2012,10(1):1020-1023.

[19]Cambrolle J,Mancilla-Leyton J M,Munoz-Valles S,et al.Zinc tolerance and accumulation in the salt-marsh shrubHalimioneportulacoides[J].Chemosphere,2012,86(9):867-874.

[20]邱莉萍,张兴昌.Cu、Zn、Cd和EDTA对土壤酶活性影响的研究[J].农业环境科学学报,2006,25(1):30-33.

[21]王学锋,罗晓东,皮运清.EDTA对Pb、Cd及Pb-Cd处理下茼蒿中叶绿素的影响[J].环境科学与技术,2011,34(1):52-55.

[22]代惠萍,赵桦,曹婷,等.Zn2+胁迫对4种紫花苜蓿光合色素的影响[J].西北农业学报,2014,23(3):128-132.

Responses to Zn and EDTA Chelating Agents on Photosynthesis Characteristics of Alfalfa Leaves

DAI Huiping1,2,3,ZHAO Hua2,JIA Genliang4,FENG Baili5

(1.Shaanxi University of Technology,Shaanxi Province Key Laboratory of Bio-resources,Hanzhong723001,China;2.College of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong723001,China;3.College of Life Sciences,Lanzhou University,Gansu Key Laboratory of Biomonitoring and Bioremediation for Environmental Pollution,Lanzhou730000,China;4.College of Science,Northwest A&F University,Yangling712100,China;5.Northwest A & F University,State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling712100,China)

Abstract：In order to explore the effective avenue on improving alfalfa(Medicage sativa L.)resistant ability under zinc stress,pot experiments were used to study the effect of EDTA on zinc accumulation,photosynthetic pigment content and chlorophyll fluorescence under zinc stress in different alfalfa leaves of three cultivars Medicago sativa ssp.,Vitoria Alfalfa and Medicago sativa cv..The results of this study indicated that the zinc contents in three cultivar leaves were significantly higher than that in control group.Compared with zinc stress alone,the addition of EDTA strikingly enhanced the zinc absorption in leaves.In comparison with different cultivars,photosynthetic pigment content in Medicago sativa ssp.was higher than that in control group.After EDTA treatment,the contents of chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoids were 12.7%,11.8%,12.5%,14.8% of Medicago sativa ssp.respectively,which were remarkably higher than that in the other two cultivars.Fo,Fv,Fm and Fv/Fm levels were increased by 5.4%,14.9%,18.1%,4.0% of Medicago sativa ssp.with the treatment of EDTA.Our research indicated that EDTA was able to promote the accumulation of photosynthetic pigment,reduce the dissipation of excessive excitation energy,improve the transmission efficiency of photosynthetic electron,and minimize the damages to alfalfa leaves PSⅡ caused by zinc stress effectively,all of which coherently boosted resistance capability to zinc in Medicago sativa ssp.cultivar.As the results suggested,EDTA with the appropriate concentration at 10 μg could coefficient alleviate the damage of Zinc stress to Medicago sativa ssp.,reduce dissipation of excess excitation and improve photochemical electron transport efficiency and efficiently protect from PSⅡ damage,EDTA obviously promoted the Zinc resistance of Medicago sativa ssp.under Zinc stress.

Key words:Zinc;Ethylene diamine tetraacetic acid;Medicage sativa L.;Chlorophyll;Chlorophyll fluorescence

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.019

中图分类号：S551.01

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0114-06

作者简介：代惠萍(1972-),女,陕西武功人,副教授,博士,主要从事植物逆境生理学、植被恢复理论与技术研究。

基金项目：陕西省教育厅重点项目(15JS019);陕西省自然基金项目(2015JM3086);甘肃省环境生物监测与修复重点实验室开放基金项目(GBBL2015006)；国家大学生创新创业训练计划项目(201510720570)；陕西省大学生创新创业训练计划项目(1970)；陕西理工学院大学生创新创业训练计划项目(UIRP15034)；国家大学生创新创业训练计划项目(201510720570)

收稿日期：2016-02-14