过表达和抑制表达2-Cys Prx基因烟草的生长、生理特性和叶片光合功能对模拟酸雨的响应

代　欣,张秀丽,胡举伟,孙广玉

(东北林业大学 生命科学学院,黑龙江 哈尔滨　150040)



过表达和抑制表达2-CysPrx基因烟草的生长、生理特性和叶片光合功能对模拟酸雨的响应

代欣,张秀丽,胡举伟,孙广玉

(东北林业大学 生命科学学院,黑龙江 哈尔滨150040)

摘要：为揭示2-Cys Peroxiredoxins (2-Cys Prx)基因在烟草龙江911抗逆中的功能,以过表达2-Cys Prx基因烟草、抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗为试材,研究了不同pH值的模拟酸雨对其生长指标、叶片生理生化特性和叶片光合生理的影响。结果表明:与对照相比,pH值4.0的模拟酸雨对3种基因型烟草的株高、叶面积、比叶重无明显影响,pH值2.5的模拟酸雨处理下,与对照相比,过表达2-Cys Prx基因烟草幼苗的株高无明显变化,抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗的株高显著降低;随着模拟酸雨pH值降低,3种基因型烟草叶片的硝酸还原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量、SOD和APX活性、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、实际光化学效率(ФPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、光系统Ⅱ潜在光化学效率(Fv/Fo)和细胞膜稳定指数逐渐下降,非光化学猝灭系数(qN)和H2O2含量逐渐增加,但在相同pH值的模拟酸雨处理下,过表达2-Cys Prx基因烟草各项生理指标均优于抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗。由此可知,增强2-Cys Prx基因在烟草中的表达可能提高烟草在模拟酸雨处理下的硝态氮利用能力,并在模拟酸雨处理造成APX活性下降时,清除叶绿体中的H2O2,使光合电子传递链保持稳定,增强烟草叶片的光合能力。

关键词：烟草;2-Cys Prx基因;模拟酸雨;光合功能

随着工业的发展,人类活动排放的SO2和氮氧化物(NOX)日益增多,并在大气中发生一系列化学反应转化为硫酸、硝酸和亚硝酸,溶于水中以雨水、冻雨、雪、雹、露等大气降水的形式落到地面,形成pH值小于5.6的酸雨[1]。酸雨也称作酸沉降(Acid deposition),有干沉降和湿沉降2种,通常所说的酸雨属于湿沉降[2]。酸雨可对植物的正常生长造成不利影响,目前国内外关于酸雨对植物生长和生理活动的影响已有大量报道[3-6]。相关研究结果表明:酸雨胁迫可影响植物的正常生长、光合生理功能和生理代谢活动[7-13]。

植物叶绿体中的Peroxiredoxins(Prxs),即2-Cys Prx,是一类通过其所具有的半胱氨酸残基(-Cys)清除叶绿体内H2O2的叶绿体蛋白[14-15]。非生物胁迫条件可促进2-CysPrx基因的表达,从而在非生物胁迫导致APX活性下降时,清除叶绿体内的H2O2,降低活性氧对植物光合机构的伤害,增强植物对非生物胁迫的耐受能力[16]。前人的研究指出在干旱和强光胁迫下,转2-CysPrx基因烟草(Nicotianatabacum)光系统Ⅱ的光化学活性和光合电子传递链的稳定性高于非转基因烟草,有利于增强烟草对所处逆境的抗性[17-18],而目前关于转2-CysPrx基因烟草对酸雨胁迫响应的研究尚未见报道。为此,本试验比较了模拟酸雨胁迫对过表达2-CysPrx基因烟草、抑制表达2-CysPrx烟草和非转基因烟草生长、生理生化特性和叶片光系统Ⅱ功能影响。旨在为探究2-CysPrx基因的功能提供基础理论。

1材料和方法

1.1试验材料

本试验于2015年7月在东北林业大学植物生理学实验室进行。试验材料为过表达2-CysPrx基因烟草(Nicotianatabacum)幼苗(G)、抑制表达2-CysPrx基因烟草幼苗(Y)和非转基因烟草幼苗(D)。过表达2-CysPrx基因和抑制表达2-CysPrx基因植株由东北林业大学植物生理学实验室通过反转录克隆出2-CysPrx基因,分别构建了过表达和抑制表达载体,通过电击法导入农杆菌LBA4404中,利用农杆菌叶盘法转化烟草而获得[19]。对过表达2-CysPrx基因和抑制表达2-CysPrx基因植株进行PCR阳性筛选,确保试验所用试材为阳性植株。本试验所用的烟草品种为龙江911。

1.2试验设计

将生根培养后的烟草植株移栽到高15 cm、直径12 cm的培养盆中,每盆一株,以草炭土、蛭石(V∶V=2∶1)的混合物作为栽培基质。移栽后在光照强度200 μmol/(m2·s),光周期12 h/12 h(光照/黑暗),温度25～30 ℃,相对湿度60%左右的人工气候室中培养,并定期浇水。待植株生长至4叶1心时选取长势一致的烟草植株进行酸雨处理。根据黑龙江省酸雨污染特征以及前人配制酸雨的方法[5,20],试验中喷淋的酸雨按H2SO4∶HNO3=8∶1(V/V),用98%浓度H2SO4和68%浓度HNO3配制酸雨母液,用蒸馏水对酸雨母液进行稀释,分别配制成pH值5.6(CK)、pH值4.0(中度)和pH值2.5(重度)3个模拟酸雨梯度。过表达2-CysPrx基因烟草幼苗(G)、抑制表达2-CysPrx基因烟草幼苗(Y)和非转基因烟草幼苗(D)都分别喷淋3个梯度酸雨,以喷淋pH值5.6酸雨的处理为对照CK,每2 d喷淋一次,每株喷淋量约为200 mL,以叶片滴液为度,共处理20 d。每个处理设置3次重复。

1.3测定项目

用直尺测量烟草植株的株高,采用剪纸称重法测定烟草植株从顶端往下数第2片完全展开叶的叶面积。叶绿素和类胡萝卜素含量采用分光光度法测定[21]。超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用NBT还原法[22]。抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定采用Streeter等[23]方法。按苏州科铭公司生产的试剂盒说明书测定过氧化氢含量(H2O2)。硝酸还原酶(NR)活性的测定参照孔祥生等[24]方法。可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250法[25]。采用电导率法测定细胞膜稳定性指数[26]。

试验于上午9:00-11:00时,采用英国Hansatch公司生产的便携式脉冲调制荧光仪FMS-2测定从上至下第2片完全展开叶的实际光化学效率(ФPSⅡ)、电子传递速率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(qN),以及叶片暗适应0.5 h后的初始荧光值(Fo)、最大荧光值(Fm)和光系统Ⅱ潜在光化学效率(Fv/Fo)。

利用Li-6400XT便携式光合仪(美国LI-COR公司生产)的红蓝光源叶室,并控制样品室CO2浓度为400 μmol/mol,叶室光照强度为400 μmol/(m2·s),叶片温度控制为28 ℃,相对湿度60%。测定烟草植株从上至下第2片完全展开叶的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)[5]。以上各处理测定指标均重复3次。

1.4数据处理

采用Excel 2003软件进行数据处理,采用SPSS软件的最小显著差异法(LSD)和多因素方差分析不同处理间的差异。

2结果与分析

2.1模拟酸雨对烟草生长特性、叶绿素含量的影响

由表1可以看出,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草的株高、叶面积和比叶重都呈现减小的趋势。在pH值4.0、pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草幼苗的株高、叶面积与对照差异不显著。在pH值2.5处理下,非转基因烟草、抑制表达2-CysPrx基因烟草的株高分别比对照降低了39.29%,62.74%,达到差异显著水平,而叶面积与对照差异不显著。对于过表达2-CysPrx基因烟草和非转基因烟草,在pH值2.5处理下,比叶重分别比对照降低了13.48%,24.44%,达到差异显著水平。对于抑制表达2-CysPrx基因烟草,pH值4.0、pH值2.5处理的比叶重与对照差异不显著。

由表2可知,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草叶片的叶绿素含量总体呈现降低的趋势,在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片的总叶绿素含量与对照相比差异不显著,对于非转基因烟草,pH值2.5处理的总叶绿素含量比对照降低了31.32%,达到差异显著水平。除非转基因烟草在pH值2.5处理下,叶绿素a含量显著低于对照;在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片的叶绿素a、叶绿素b与对照无显著差异。

表1　模拟酸雨对烟草生长特性的影响

注:表中数据为均值±标准差。图中标注的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表2、图1～5同。

Note:Different letters mean significant difference(P<0.05).The same as Tab.2,Fig.1-5.

表2　模拟酸雨对烟草叶绿素含量的影响

2.2模拟酸雨对烟草叶片硝酸还原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量的影响

由图1可知,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草叶片的硝酸还原酶活性(NR)、可溶性蛋白含量都呈现降低的趋势。在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片的硝酸还原酶(NR)活性分别比对照降低42.97%,66.14%,45.13%;可溶性蛋白含量分别比对照降低了38.88%,46.15%,57.95%,都达到差异显著水平。在pH值2.5处理下,3种基因型烟草叶片的硝酸还原酶活性(NR)、可溶性蛋白含量仍呈现为过表达2-CysPrx基因烟草>非转基因烟草>抑制表达2-CysPrx基因烟草。

图1　模拟酸雨对烟草叶片硝酸还原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量的影响

2.3模拟酸雨对烟草叶片光合特性的影响

由图2可知,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)呈现降低的趋势。在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)均明显低于对照,且3种基因型烟草叶片的净光合速率(Pn)呈现为过表达2-CysPrx基因烟草>非转基因烟草>抑制表达2-CysPrx基因烟草。而随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草的胞间CO2浓度(Ci)呈现增加的趋势,在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因的烟草、非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片的胞间CO2浓度(Ci)均显著高于对照。

图2　模拟酸雨对烟草叶片光合特性的影响

2.4模拟酸雨对烟草叶片叶绿素荧光参数的影响

由图3可以看出,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草叶片PSⅡ的实际光化学效率(ФPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)和光系统Ⅱ潜在光化学效率(Fv/Fo)呈现下降趋势。在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片PSⅡ的实际光化学效率(ФPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)分别比对照降低了29.77%,27.85%,31.83%;26.62%,25.23%,25.23%,均达到差异显著水平。3种基因型烟草的非光化学猝灭系数(qN)在pH值4.0、pH值2.5处理下与对照差异不显著。在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、抑制表达2-CysPrx基因烟草的PSⅡ潜在光化学效率(Fv/Fo)分别比对照降低了18.65%,21.88%,达到差异显著水平。

图3　模拟酸雨对烟草叶片叶绿素荧光参数的影响

2.5模拟酸雨对烟草叶片SOD、APX活性的影响

由图4可以看出,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草叶片的SOD、APX活性逐渐降低。在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片的SOD、APX活性分别比对照降低了31.35%,34.99%,71.63%;26.06%,38.59%,33.60%,达到差异显著水平,且在pH值2.5处理下SOD、APX活性均表现为过表达2-CysPrx基因烟草>非转基因烟草>抑制表达2-CysPrx基因烟草。

图4　模拟酸雨对烟草叶片SOD、APX活性的影响

2.6模拟酸雨对烟草叶片H2O2含量和细胞膜稳定指数的影响

由图5可知,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草叶片的H2O2含量逐渐增加,在pH值2.5处理下,过表达2-CysPrx基因烟草、非转因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片的H2O2含量分别比对照增加了45.81%,17.11%,15.36%,达到差异显著水平,且在pH值2.5处理下H2O2含量表现为过表达2-CysPrx基因烟草<非转基因烟草<抑制表达2-CysPrx基因烟草;而3种基因型烟草叶片的细胞膜稳定指数随模拟酸雨pH值的降低,逐渐下降,在pH值2.5处理下细胞膜稳定指数表现为过表达2-CysPrx基因烟草>非转基因烟草>抑制表达2-CysPrx基因烟草,与对照相比均差异不显著。

图5　模拟酸雨对烟草叶片H2O2含量和细胞膜稳定指数的影响

3讨论

较多研究表明,酸雨对植物生长产生影响的临界点pH值为2～3[27-28],本试验研究结果表明:3种基因型烟草的株高、叶面积和比叶重随模拟酸雨pH值的降低而逐渐降低,在pH值2.5处理下,与对照相比,过表达2-CysPrx基因烟草株高无显著变化,而抑制表达2-CysPrx基因烟草和非转基因烟草株高显著降低,且3种基因型烟草的株高表现为过表达2-CysPrx基因烟草>非转基因烟草>抑制表达2-CysPrx基因烟草,说明增强2-CysPrx基因在烟草叶片中的表达可减轻酸雨胁迫对烟草生长的影响。叶绿素参与对光能的吸收、传递以及转换,其含量的高低可直接影响植物的光合作用。关于酸雨胁迫对植物叶片叶绿素含量影响的报道较多,张远兵等[28]研究发现随着酸雨pH值的降低,吊竹梅(Zebrinapendula)叶片叶绿素含量逐渐降低;袁远爽等[29]对白簕(Acanthopanax)的研究则表明,随着模拟酸雨pH值的降低,白簕叶片叶绿素含量呈先升高后降低趋势。本试验研究结果表明,随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草叶片的叶绿素(叶绿素(a+b))含量总体呈降低趋势,但降低幅度较小,这与鲁美娟等[30]的研究结果相似。这可能是由于烟草叶绿素的代谢对酸雨胁迫不敏感。

酸雨对植物膜系统的损伤必然会引起光合器官的伤害和功能的下降[32-33],西洋杜鹃在酸雨pH值≤3.0时,Pn、Tr和Gs明显降低,其净光合速率的下降是由气孔限制导致的[34]。本试验研究结果发现,在酸雨处理下,3种基因型烟草随着酸雨pH降低叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)逐渐降低,胞间CO2浓度(Ci)逐渐增加,这说明烟草净光合速率(Pn)下降导致气孔导度(Gs)的降低,酸雨胁迫下净光合速率的下降是由非气孔限制引起的。结合酸雨处理下,3种基因型烟草叶片可溶性蛋白含量显著降低,而核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是植物叶片中可溶性蛋白的主要组成部分,因此，酸雨处理下核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶含量可能显著降低,这将直接影响卡尔文循环中CO2的羧化速率,表现为净光合速率的下降。由于在相同pH值模拟酸雨处理下,过表达2-CysPrx基因烟草叶片的可溶性蛋白含量均显著高于抑制表达2-CysPrx基因烟草和非转基因烟草,这可能是造成过表达2-CysPrx基因烟草叶片净光合速率在相同pH值模拟酸雨处理下显著高于非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草的原因之一,这同时也说明,增强2-CysPrx基因有利于提高烟草叶片在酸雨胁迫下的光合能力。

叶绿素荧光技术是研究植物对逆境耐受能力的常用技术[35],杉木幼苗在pH值2.5酸雨处理下,qP、Fv/Fo显著降低,qN显著增加[36]。本试验中,随着模拟酸雨pH值的降低,在3种基因型烟草叶片光系统Ⅱ的ФPSⅡ、qP显著降低,非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草叶片光系统Ⅱ的qN明显增加,Fv/Fo明显降低,表明酸雨胁迫可引起烟草叶片PSⅡ的光化学活性降低,PSⅡ捕获的激发能用于光化学反应的比例下降,非光化学猝灭耗散掉的激发能明显增加,从而导致光合电子传递链的同化力(ATP和NADPH)产额降低,可用于暗反应的同化力减少,引起暗反应光合碳同化能力降低,表现为净光合速率的下降。但在不同pH值模拟酸雨处理下,过表达2-CysPrx基因烟草叶片PSⅡ的ФPSⅡ、qP均明显高于非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草,这可能是由于增强2-CysPrx基因在烟草叶片中的表达可减轻模拟酸雨胁迫下叶绿体中的H2O2对PSⅡ光化学活性的抑制,使光合电子传递链基本保持稳定。酸雨对植物产生伤害主要是由于酸雨胁迫下抗氧化酶活性降低,导致活性氧代谢平衡失调,相对过剩的活性氧的膜质过氧化作用增强,造成氧化伤害[4-5]。本试验研究结果表明:随着模拟酸雨pH值的降低,3种基因型烟草的细胞膜稳定性指数明显降低,且在不同pH处理下细胞膜稳定指数均表现为过表达2-CysPrx基因烟草>非转基因烟草>抑制表达2-CysPrx基因烟草,说明酸雨胁迫下过表达2-CysPrx基因烟草膜质过氧化水平低于非转基因烟草和抑制表达2-CysPrx基因烟草。同时,3种基因型烟草叶片中SOD、APX活性随模拟酸雨pH值的降低而下降,对活性氧的清除能力下降,本试验中3种基因型烟草叶片中的H2O2含量增加也证明了这一点。H2O2的积累量增加可导致膜透性增加,造成叶绿体结构受损,还会破坏D1蛋白上的His残基从而抑制光合电子传递链的电子传递、降低PSⅡ反应中心的光化学活性、抑制植物的光合作用等[37],但过表达2-CysPrx基因烟草可通过2-CysPrx基因过表达合成2-Cys Prx,在APX活性降低的情况下,清除叶绿体内的H2O2,减轻H2O2对PSⅡ光化学反应的抑制作用。

综上所述,在pH值2.5酸雨处理下,对3种基因型烟草生长的影响表现为过表达2-CysPrx基因烟草<非转基因烟草<抑制表达2-CysPrx基因烟草,这可能是由于过表达2-CysPrx基因烟草可在重度酸雨胁迫下,保持相对较高硝态氮利用能力,有利于植物合成蛋白质,使核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶含量维持在较高水平有利于CO2羧化的进行;同时通过2-CysPrx基因过表达合成的2-Cys Prx清除叶绿体内的H2O2,减轻H2O2对光合机构的破坏,相对增强光合电子传递链的稳定性,从而使过表达2-CysPrx基因烟草的净光合速率基本保持稳定。这也可能是过表达2-CysPrx基因烟草对酸雨抗性优于非转基因烟草、抑制表达2-CysPrx基因烟草的原因。

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Responses of Growth and Physiological Features,Photosynthetic Function in Overexpression and Inhibition of Expression of Transgenic Tobacco Plants with 2-CysPrxto the Simulated Acid Rain

DAI Xin,ZHANG Xiuli,HU Juwei,SUN Guangyu

(College of Life Science,Northeast Forest University,Harbin150040,China)

Abstract：The overexpression and inhibition of expression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx (Longjiang 911),non transgenic tobacco were chosen to investigate the effects of simulated acid rain on their growth,physiological features and photosynthesis.The results showed that simulated acid rain at pH 4.0 had no significant effects on the plant height,leaf area and specific leaf weight,but at pH 2.5,the plant height of overexpression and inhibition of expression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx reduced significantly,With the pH value of the simulated acid rain decreased,chlorophyll content,nitrate reductase activity,soluble protein content,superoxide dismutase and ascorbate peroxidase activity,net photosynthetic rate(Pn),stomatal conductance(Gs),transpiration rate(Tr),the actual photochemical efficiency of PSⅡ(ΦPSⅡ),photochemical quenching coefficient(qP),potential photochemical efficiency of PSⅡ(Fv/Fo)and cell membrane stability index decreased,the non-photochemical quenching(qN)and hydrogen peroxide content increased,but at the same pH value,these above-mentioned indexes of overexpression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx were better than inhibition of expression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx and non transgenic tobacco plant.The results suggest that enhanced expression of 2-Cys Prx in tobacco plant can promote the capability of tobacco against acid rain,the capability of utilizing nitrate nitrogen,and remove of excess H2O2 while APX activity decreases,and enhance the photosynthetic capability of tobacco.

Key words:Tobacco;2-Cys Prx gene;Simulated acid rain;Photosynthetic function

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.010

中图分类号：S572.01

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0052-08

作者简介：代欣(1991-),女,黑龙江建三江人,在读硕士,主要从事植物生理生态学研究。通讯作者：孙广玉(1963-),男,黑龙江巴彦人,教授,博士,主要从事植物生理生态学研究。

基金项目：哈尔滨市科技创新人才研究专项(2013RFXXJ063)

收稿日期：2016-02-20