肝窦内皮细胞凝集素抑制肝星形细胞增殖、胶原合成与分泌的实验研究*

西安高新医院耳鼻咽喉科(西安710075)　孙　安　范郁会　 杨洁英　 江玉刚　 乔立敏　王继波　李元峰



肝窦内皮细胞凝集素抑制肝星形细胞增殖、胶原合成与分泌的实验研究*

西安高新医院耳鼻咽喉科(西安710075)孙安范郁会 杨洁英▲江玉刚 乔立敏王继波李元峰

摘要目的：探讨肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)对肝脏星形细胞(HSCs)增殖和胶原分泌的影响。方法：离体培养大鼠肝星形细胞系 HSC-T6，分为对照组和LSECtin处理组。采用噻唑蓝(MTT)比色法和[3H]-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)掺入法检测 HSC-T6细胞的增殖情况，分别采用[3H]-脯氨酸掺入法和比色法检测 HSC-T6细胞胶原合成与分泌的情况。结果：LSECtin剂量依赖性的抑制 HSC-T6细胞增殖，其中10-7mol/L 的LSECtin对HSC-T6细胞增殖的抑制率为50%。另外，LSECtin对于HSC-T6细胞胶原的合成与分泌也有显著地抑制效应，并呈剂量关系。其中，10-7mol/L 的LSECtin对HSC-T6细胞胶原合成与分泌抑制率分比为55%和52%。结论：LSECtin是肝星形细胞的增殖、胶原合成与分泌的抑制因子，对于肝纤维化具有潜在的治疗价值。

主题词肝星形细胞细胞增殖肝纤维化@肝窦内皮细胞凝集素

大多慢性肝病的发展经历着共同的过程，从轻微的炎症发展到严重的炎症、肝纤维化，最终导致肝硬化。肝纤维化是许多慢性肝病的终末阶段。肝纤维化被认为是肝脏对慢性肝损伤所做出的创伤愈合反应模式。在损伤过程中肝实质细胞和非实质细胞参与了反应，激活细胞因子和细胞外信号的产生，引起细胞外基质(ECM)蛋白在肝内沉积是肝纤维化发生的基本机制。肝星形细胞位于窦周间隙，呈周细胞样排列，伸出长的细胞突起围绕着肝窦。被激活时肝星形细胞(HSC)增殖并合成细胞外基质蛋白，形成肝纤维瘢痕，这在肝纤维化和门静脉高压的发病中起重要作用。肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)是C-型凝集素家族中的一员，由军事医学科学院贺福初等首先克隆。它表达在肝脏窦内皮细胞和淋巴结窦内皮细胞，以及胸腺巨噬细胞和外周血树突细胞(DCs)上[1-2]，在机体免疫中发挥重要的作用。比如，髓系细胞中的LSECtin能够调控抗原捕获和病原体结合[3]，能够粘附埃博拉及SARS病毒，但不结合HIV及HCV病毒[4]；在保护肝脏免疫调节中起着很大作用[5]。本研究以肝星形细胞为研究对象，观察LSECtin对于细胞增殖，以及胶原合成与分泌的影响，旨在揭示LSECtin在肝纤维化进程中的作用，为临床治疗提供实验依据。

材料与方法

1材料重组LSECtin购自美国R&D公司。[3H]-脱氧胸腺嘧啶核苷酸([3H]-TdR)和[3H]脯氨酸均购自北京中国原子能研究所。四甲偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司。脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物医学科技公司产品。HSC-T6星形细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司。按照加入LSECtin的浓度，将细胞分为4组。分别以0 mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L的LSECtin处理。其中，0 mol/L的LSECtin处理组为对照。

2方法①细胞培养。将细胞培养在含10 %胎牛血清的DMEM培养液中，在5%CO2和95%O2，37℃条件下恒温孵育。②噻唑蓝(MTT)比色法和[3H]-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)掺入法检测 HSC-T6细胞的增殖情况。接种细胞：用含10%胎牛血清得培养液配成单个HSC-T6细胞悬液，将细胞置于96孔板中(每孔5×103个细胞)，每孔培养液体积200 μl，培养24 h，换无血清培养基同步化24h，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中加入LSECtin培养24 h，(对照组不给LSECtin)，在最后4h每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl 二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。DNA合成检测：将细胞置于96孔板中(每孔5×103个细胞)，检测其表达[3H]-胸苷标记DNA的细胞数目。每孔培养液体积200μl，培养24h，换无血清培养基同步化24h后，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中加入LSECtin培养24h，(对照组不给LSECtin)，在最后4h，每孔加入[3H]-胸苷(18.5 kBq/ml)。用放射免疫计数仪(LS-6500， Beckman Co.CA，USA)检测每个样本的放射性。③[3H]-脯氨酸掺入法和比色法检测 HSC-T6细胞胶原合成与分泌的情况。胶原合成检测：将细胞置于96孔板(每孔5×103个细胞)，检测其表达[3H]-脯氨酸标记的胶原的细胞数。如前所述，换无血清培养基同步化24 h后，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中加入LSECtin培养24 h(对照组不给予LSECtin)，在最后4h时每孔加入[3H]-脯氨酸(18.5 kBq/ml)。用放射免疫计数仪(LS-6500，Beckman Co.CA，USA)检测每个样本的放射性。胶原分泌水平检测：把细胞铺于90 mm培养皿(1×106个细胞每皿)。置于无血清培养基上同步化24 h后，再在含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中加入LSECtin培养24 h。采用碱水解法测定所收集各组细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。操作方法参照说明书。

3统计学方法所有的实验都重复了至少3次。结果用均数±标准差表示。采用单因素方差分析法(ANOVA)分析各组总体的变异情况，用t检验检测组间差异。应用SPSS 10.0统计分析，P<0.05则认为差异有统计学意义。

结果

1LSECtin 抑制肝星形细胞增殖见图1。LSECtin呈剂量依赖性地抑制细胞增殖。与对照组比较，10-9-10-8mol/L的LSECtin对于细胞的MTT光吸收值与[3H]-TdR 掺入没有显著改变。当LSECtin增加至10-8mol/L，细胞的MTT光吸收值与[3H]-TdR 掺入降低约40%。当浓度为10-7mol/L时(本实验使用的最高浓度)，LSECtin减少了MTT吸光值(图1A)和[3H]-TdR 掺入(图1B)达50%。

A：MTT比色实验；B：H3-TdR掺入实验。与对照组(LSECtin浓度为0 mol/L)比较，**P<0.01

图1LSECtin对HSC-T6细胞增殖的影响

2LSECtin抑制肝星形细胞胶原合成与分泌见图2。LSECtin呈剂量依赖性地抑制细胞的[3H]脯氨酸掺入(图2A)，并显著降低细胞培养液中的羟脯氨酸浓度(图2B)。当浓度为10-7mol/L时(本实验使用的最高浓度)，LSECtin对[3H]脯氨酸掺入的抑制率为55%，使细胞培养液中的羟脯氨酸浓度降低52%。

A：[3H]-脯氨酸掺入实验；B：碱水解法测定细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。与对照组(LSECtin浓度为0 mol/L)比较，**P<0.01

图2LSECtin对HSC-T6细胞胶原合成与分泌的影响

讨论

我们的研究首次发现LSECtin有效抑制肝星形细胞增殖，以及胶原的合成与分泌。该结果提示：LSECtin一方面可能通过抑制肝间质细胞的增殖，从而减少间质的组织的量；另一方面，可能通过抑制间质细胞产生胶原的数量，减少胶原组织在肝脏的沉积，从而抑制肝纤维化。但这还需要整体水平动物实验证据的支持，相关机制也有待于进一步研究。LSECtin可能成为一种新的肝脏的保护药物，用于防治各种疾病导致的肝纤维化病变。同时，一些能够提高内源性LSECtin表达，或者抑制内源性LSECtin降解的物质，都可能成为新的抗肝脏纤维化候选新药。

LSECtin是从肝脏中发现的 C型凝集素受体。LSECtin 特异表达于肝脏的窦内皮细胞(半抗原提呈细胞)和 Kupffer 细胞(器官特异性巨噬细胞)，识别活化 T 细胞表面的未知配体，负调节 T 细胞活化，从而抑制的急性肝炎的发生发展。这些结果说明 LSECtin 在肝脏局部免疫反应中发挥重要作用[1-2]。常远鸿等[6]研究认为：高胰岛素可能通过磷酸化ERK，促进HSC-T6增殖，上调MMP-2、TIMP-1、TIMP-2 mRNA转录，促使肝纤维化发生发展，表明肝纤维化也是一个有多种因素参与的肝脏免疫过程。这也从另一个侧面提示，LSECtin在肝纤维化过程中的可能的重要作用。由于本研究是以离体培养的肝星形细胞为研究对象，这就排出了在体条件下其他免疫细胞、免疫因子的参与。虽然本研究的结果证实了LSECtin对肝星形细胞的直接效应，但是其可能的通过免疫调节而影响肝纤维化的效应还需要进一步的实验证实。

综上所述，LSECtin是一种潜在的肝纤维化抑制因子，但是其在体效应，以及确切机制还有待于进一步研究。

参考文献

[1]Xu F，Liu J，Liu D，etal.LSECtin expressed on melanoma cells promotes tumor progression by inhibiting antitumor T-cell responses[J].Cancer Res，2014，74(13)：3418.

[2]Liu B，Wang M，Wang X，etal.Liver sinusoidal endothelial cell lectin inhibits CTL-dependent virus clearance in mouse models of viral hepatitis[J].J Immunol，2013，190(8)：4185-4195.

[3]van den Berg LM，Gringhuis SI，Geijtenbeek TB.An evolutionary perspective on C-type lectins in infection and immunity[J].Ann NY Acad Sci，2012，1253：149-158.

[4]Koharudin LM，Gronenborn AM.Antiviral lectins as potential HIV microbicides[J].Curr Opin Virol，2014，7：95.

[5]Pedersen M，Seetharam A.Infections after orthotopic liver transplantation[J].J Clin Exp Hepatol，2014，4(4)：347.

[6]常远鸿，苌新明，任莉. 高胰岛素对肝星状细胞HSC-T6增殖及MMP-2、TIMP-1、TIMP-2 mRNA转录的影响[J].陕西医学杂志，2012，41(5)：531-534.

(收稿：2015-07-03)

LSECtin inhibits the proliferation，synthesis and secretion of collagen in the HSCs

Xi’an Gaoxin Hospital (Xi’an 710075)Sun AnFan Yuhui Yang Jieyinget al

ABSTRACTObjective：To investigate the effects of LSECtin (1iver and lymph node sinusoidal endothelial cells lectin) on the proliferation，synthesis and secretion of collagen in the HSC-T6 hepatic stellate cells. Methods：HSC-T6 cells from rats liver were cultured in vitro， and assigned into control and LSECtin treatment group.MTT assay and H3-TdR incorporation were performed to evaluate the proliferation of HSC-T6 cells.[3H]-Pro incorporation and colorimetry methods were applied respectively to detect the synthesis and secretion of collagen in HSC-T6 cells.Results：LSECtin inhibited the proliferation of HSC-T6 cells in a dose-dependent manner.The inhibition ratio of LSECtin at 10-7mol/L was 50%.In addition，LSECtin inhibited the synthesis and secretion of collagen in the HSC-T6 cells dose-dependently.At the dose of 10-7mol/L，LSECtin decreased the synthesis and secretion of collagen in the HSC-T6 cells cells by 55% and 52% respectively.Conclution：LSECtin is an inhibitor of proliferation，synthesis and secretion of collagen in the HSCs，suggesting potential therapeutic values against liver fibrosis.

KEY WORDSHepatic stellate cellsCell proliferationLiver fibrosis@LSECtin

【中图分类号】R575.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.004

*陕西省卫生和计划生育委员会科研计划项目(D44)

▲通讯作者