急性淋巴细胞白血病患儿MTHFR基因多态性与大剂量甲氨蝶呤毒副反应的相关性

廖 静， 李 戈， 张 熔

(四川省人民医院儿科， 成都 610072)

急性淋巴细胞白血病患儿MTHFR基因多态性与大剂量甲氨蝶呤毒副反应的相关性

廖 静， 李 戈， 张 熔

(四川省人民医院儿科， 成都 610072)

目的：探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因677位点多态性与急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿使用大剂量甲氨蝶呤(HDMTX)化疗后毒副反应的相关性。方法： 收集46例完全缓解并接受HDMTX治疗的ALL患儿外周血，提取基因组DNA，用PCR-芯片杂交法检测MTHFR基因C677T多态性。应用荧光偏振免疫法(FPIA)测定24小时、48小时血浆MTX浓度。按照国立癌症研究所常规毒性判定标准(NCI-CTC)对患儿HDMTX化疗毒副反应进行评价。对MTHFR677位点基因多态性与HDMTX毒副反应、48小时血浆MTX浓度的相关性进行分析。结果： HDMTX化疗相关毒副反应以骨髓抑制及肝毒性为主。C677T各基因型的48h MTX血药浓度及发生各类化疗毒副反应差异无统计学意义。结论： 影响MTX的体内代谢及毒副反应的因素复杂，MTHFR C677T基因多态性尚不能作为HDMTX体内排泄及毒副反应的有效预测性指标。

亚甲基四氢叶酸还原酶； 单核苷酸基因多态性； 急性淋巴细胞白血病； 甲氨蝶呤； 毒副反应

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童恶性肿瘤最常见的类型之一，随着联合化疗方案的不断改进，其5年无事件生存率(EFS)目前已可达80%[1]。大剂量甲氨蝶呤(high-dose methotrexate,HDMTX)在预防髓外白血病、残留微小病灶的清除、减少复发、达到长期无病生存等方面发挥着难以替代的效应，但因其不同程度的毒副反应，使之在临床应用中受到限制。

遗传药理学认为个体之所以对药物具有不同的耐受性，人类基因组所具有的基因多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为主要因素。药物代谢酶基因多态性在ALL化疗疗效及毒副作用中发挥着至关重要的作用。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)是叶酸代谢途径的关键酶之一，其编码基因所具有的多态性是非常明显的，本研究选择MTHFR基因C677T位点作为研究对象，探讨此基因多态性和HDMTX毒副反应的关系，希望能找到更为安全、有效的个体化治疗方案。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究选取2013年5月到2015年5月期间在我院接受诊治的中危组和高危组ALL患儿46例，均为汉族，其中男20例，女26例，年龄1.0～12.2岁，平均(5.8±3.1)岁。排除经VDLD方案(长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、地塞米松)诱导缓解、CAM方案(环磷酰胺、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤)早期强化治疗后未达完全缓解、HDMTX化疗前血常规和肝肾功、电解质、心肌酶学指标不正常者。所有对象的诊疗已征得监护人同意并签署知情同意书，并通过我院医学伦理委员会批准。诊断标准、危险度分型及治疗方案均参照儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议(第四次修订)[2]。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 对46例ALL患儿化疗前抽取空腹静脉血2ml，EDTA抗凝，使用柱提法进行DNA的提取，具体实验步骤参考文献[3]。

1.2.2 MTHFR(C677T)基因型检测方法 采用PCR-芯片杂交法[上海百傲公司MTHFR(C677T)基因检测试剂盒]检测MTHFR(C677T)基因型。用于MTHFR677C/T扩增的上游引物为：5′-CCTTGAACAGGTGGAGGCC-3′；下游引物为5′-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGAT-3′,扩增片段长158bp。PCR反应体系包括：Tris-HCl，KCl，MgCl2，dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，上下游引物，Taq酶、UNG酶，模板。PCR扩增程序为：(1)预变性94℃，5min；(2)35个循环，变性94℃ 25s；退火56℃ 25s；延伸72℃ 25s；(3)72℃延伸5min。取出扩增物，按照百傲杂交显色试剂盒说明书要求进行杂交反应，反应结束后，应用生物芯片识读仪进行图像扫描。应用百傲MTHFR基因型分析软件进行数据分析，把MTHFR划分为CC野生型、CT杂合型、TT纯合型。

1.2.3 化疗方案 参照儿童ALL诊疗建议[2]，MTX的应用剂量，中危及高危组均为5.0g/m2，总量的1/10(不超过500mg)作为突击量于30分钟内快速静脉滴入，余量于24小时内匀速滴入。突击量MTX滴入后0.5～2小时，行三联鞘内注射(MTX、阿糖胞苷，地塞米松)。使用突击量42小时后，亚叶酸钙予以解救，用量为15mg/ m2·次，q6h，首次为静脉注射，以后为口服，共6～8次，直到MTX血药浓度≤0.1μmol/L。HDMTX治疗前、后3天口服碳酸氢钠1.0g tid，并在治疗当天给予5%碳酸氢钠5ml/kg静滴，保持尿pH≥7.0。用HDMTX当天及后3天需水化(4 000ml/m2·d)，并保护重要脏器如肝脏、肾脏功能，以及口腔黏膜、胃肠道等。在用HDMTX同时，每晚顿服6-巯基嘌呤50mg/m2，共7天。

1.2.4 毒副反应监测指标及评价 用药前及用药期间进行体格检查、实验室检查(包括血常规、转氨酶、胆红素、血肌酐及尿素氮，每周3～4次)，并参照国立癌症研究所常规毒性判定标准4.0版(NCI-CTC 4.0)对毒副反应进行评价分级。根据轻重程度将毒副反应划分为4级，1级为轻度，2～4级为中重度。白细胞(3.0～3.9)×109/L为1级、(2.0～2.9)×109/L为2级、(1.0～1.9)×109/L为3级、<1.0×109/L为4级；血红蛋白100～109 g/L为1级、80～99 g/L为2级、65～79 g/L为3级、﹤65 g/L为4级；血小板(75～99)×109/L为1级、(50～74.9)×109/L为2级、(25～49.9)×109/L为3级、﹤25×109/L为4级；转氨酶1～2.5N(N=40U/L)为1级、2.6～5N为2级、5.1～10N为3级、>10N为4级；口腔粘膜损害无痛性溃疡，红斑或有轻度疼痛为1级、疼痛性红斑水肿或溃疡，但能进食为2级、疼痛性红斑水肿或溃疡，不能进食为3级、需胃肠外支持治疗为4级；胃肠道反应以呕吐为主要表现，1次/24h为1级、2～5次/24h为2级、6～10次/24h为3级、>10次/24h为4级。

1.2.5 MTX血药浓度测定 自HDMTX开始后24、48小时各抽取2毫升静脉血，送至我院药剂科采用荧光偏振免疫法(FPIA)测定MTX血药浓度。48小时MTX血药浓度≥1μmol/L，为排泄延迟[4]。

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0软件处理数据，使用χ2比较MTHFR各基因型的HDMTX化疗毒副反应发生率的差异。采用Fisher′s精确概率法比较不同基因型48小时MTX血药浓度的差异。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTHFR 677基因型的分布

采用PCR-芯片杂交法确定46例患儿MTHFR 677位点的基因型分别为TT纯合型、CT杂合型、CC野生型。各基因型图像扫描如图1所示。其中CC野生型19例(41.3%)，CT杂合型16例(34.8%)，TT纯合型11例(23.9%)。

图1 MTHFR基因型扫描结果

2.2 毒副反应

HDMTX相关毒副反应主要表现为外周血白细胞减少(71.7%)、血红蛋白减少(65.2%)、血小板减少(54.3%)、转氨酶升高(37.0%)，毒性以2～4级为主，结果见表1。其他不良反应如口腔黏膜炎、胃肠道反应发生率较低。

表1 46例ALL患儿HDMTX相关毒副反应发生率[n(%)]

2.3 MTHFR基因型和HDMTX化疗相关毒副反应的关系

MTHFR C677T各基因型与化疗所致中重度(≥2级)毒副反应差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表2，其他中重度毒副反应(口腔黏膜炎、胃肠道反应)发生率较低，故无法分析其与基因型的关系。

表2 MTHFR基因型和HDMTX毒副反应的关系[n(%)]

2.4 MTHFR基因型与48h MTX血药浓度的关系

48小时 MTX血药浓度≥1μmol/L的基因型分布频率由高到低为TT型54.5%、CT型37.5%、CC型21.1%，提示MTHFR突变基因型(CT+TT)MTX有排泄延迟，但差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表3。

表3 MTHFR基因型与48h MTX血药浓度的关系[n(%)]

3 讨 论

HDMTX在儿童ALL联合化疗方案中，对髓外白血病预防及持续缓解有着重要意义，但因其毒副反应发生率较高，限制了其在临床中的使用，是阻碍患儿EFS进一步提高的重要原因之一。本研究参照《儿童急性淋巴白血病诊疗建议(第四次修订)》的治疗方案，将患儿分为低危组、中危组和高危组，并分别给予不同剂量的甲氨蝶呤进行化疗。由于使用剂量直接影响化疗毒副反应程度，因此本研究剔除了低危组数据，保留了使用同等剂量的中危组和高危组，共获得46个病例。

HDMTX常见毒副反应为：(1)骨髓抑制；(2)肝肾功能损害；(3)胃肠道反应；(4)皮肤粘膜损害。其他如变态反应、脑白质损害相对较少。本研究毒副反应以骨髓抑制发生率最高，主要表现为外周血白细胞减少(71.7%)、血红蛋白减少(65.2%)、血小板减少(54.3%)，毒性以2～4级为主，多数病例骨髓抑制出现在HDMTX后第4天，持续时间不超过10天，多数在下一疗程前已经恢复，不影响下个疗程进行。肝脏是MTX代谢和分解的主要场所，所以肝毒性的发生率也十分常见，本研究肝毒性主要表现为转氨酶升高(37.0%)，未见黄疸、腹水、凝血功能异常等不良反应。肝毒性多出现于化疗后第5天，多经过保肝治疗后于10天左右恢复正常。此外，胃肠道反应占21.7%，主要表现为轻度恶心、呕吐，可能与化疗前常规预防性应用抗呕吐药及胃粘膜保护剂有关，且多在MTX结束后呕吐缓解。MTX是S期抑制性药物，由于消化道粘膜细胞增殖迅速，对MTX较为敏感，故易出现口腔、肛门、消化道粘膜损害，严重粘膜损害甚至可能致死。本研究中，口腔粘膜损害发生率较低，仅占10.9%，且以轻度为主，可能与注重水化、碱化，且常规预防性使用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子含漱有关。本研究中无1例肾脏损害或严重致死性毒副作用发生。因此HDMTX期间，及时应用亚叶酸钙解救，充分水化、碱化，并积极对症、止吐、保护粘膜，多数患儿毒副作用程度较轻，经对症处理后，多于1～2周恢复。

MTX是叶酸还原酶抑制剂，主要抑制二氢叶酸还原酶从而使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中一碳基团的转移作用受阻，导致DNA生物合成受到抑制。MTHFR作为叶酸代谢的限速酶，可催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，从而为体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化提供甲基。MTHFR基因突变频率较高的位点是677C/T，发生C→T的碱基替代，造成蛋白质肽链中的第222位氨基酸发生变化，由GCC丙氨酸(Ala)变为GTC缬氨酸(Val)，导致MTHFR活性降低[5]。体外淋巴细胞酶活性显示，MTHFR 677TT纯合型与677CT杂合型二者的活性分别是677CC野生型的30%与60%[6]。这将会产生两种生物学作用，一方面是MTX在细胞内对二氢叶酸向四氢叶酸的转化产生抑制，造成细胞内的二氢叶酸及毒性代谢产物多聚谷氨酸蓄积，并且使得还原型叶酸减少，造成嘌呤与胸腺嘧啶合成障碍，对DNA复制产生抑制作用。另一方面，MTHFR基因突变后，活性降低也减少5-甲基四氢叶酸的利用，这就间接造成了患儿体内甲基化反应包括DNA、RNA和蛋白质甲基化的减低，导致DNA的修复能力及mRNA的稳定性下降。二者产生协同效应，造成MTHFR 677C→T突变患儿对MTX的敏感性增加，相关毒副反应增加以及MTX排泄延迟[7]。

本研究发现，C677T各基因型发生各类HDMTX化疗毒副反应的差异无统计学意义。48小时 MTX血药浓度≥1μmol/L的基因型分布频率由高到低为TT型54.5%、CT型37.5%、CC型21.1%，提示MTHFR突变基因型(CT+TT)MTX有排泄延迟，但差异无统计学意义(P>0.05)，这与郑苗苗等[8]及国外一些学者的研究结果一致[9-10]。而杨丽华[11]及Imanishi等[12]发现MTHFR C677T多态性与MTX排泄延迟、肝毒性均有相关性。Lopez[13]等报道MTHFR 677TT是MTX相关黏膜炎的高危因素。

众多的研究结论之所以不同，原因可能有如下几个方面：等位基因对于不同种族而言，存在频率差异，再加上基础疾病不同、血清叶酸水平以及饮食习惯、同时服用药物不同等诸多的环境因素一起造成研究结果不同[14]。除了上述因素之外，造成研究结论不一样的原因还可能与样本量有限、MTX初始剂量不同、化疗方案不同等相关。目前已有较多研究显示，影响HDMTX化疗毒副反应的因素，还可能有亚甲基四氢叶酸脱氢酶[15]、胸苷酸合酶[16]、还原型叶酸载体[16]、γ-谷氨酰水解酶[17]等基因多态性，它们可能相互协同、相互制约，最终造成毒副反应不一。

综上所述，本研究认为MTHFR C677T基因多态性和HDMTX相关毒副反应间无相关性，故尚不能单独作为HDMTX毒副反应的有效预测性指标。但因研究样本例数偏少，后续研究将扩大样本量继续研究MTHFR 基因677位点和该基因更多的位点及其他与叶酸代谢相关基因与MTX药物代谢和毒性反应的关系，期待大规模的样本和更细致的研究方案来证实本实验结果，为儿童ALL个体化治疗提供更详尽的理论依据。

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Association of Methylenetetrahydrofolatereductase Gene Polymorphism and Adverse Reaction of High Dose Methotrexate Treatment in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia

Liao Jing, Li Ge, Zhang Rong

(DepartmentofPediatrics,SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,Sichuan,China)

Objective: To study the association between methylenetetrahydrofolatereductase (MTHFR) gene C677T polymorphism and toxicities after high-dose methotrexate (HD-MTX) infusion in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods: Peripheral blood samples of 46 children with ALL at complete remission stage accepting the treatment of HD-MTX were collected. Genomic DNA was extracted. Genotype of MTHFR was detected by PCR-chip hybridization technology. The plasma MTX concentration at 24h and 48h after the start of HDMTX was detected with fluorescence polarization immunoassay (FPIA). Toxicities of HDMTX were evaluated according to the National Cancer Institute-Common Toxicity Criteria (NCI-CTC). Results: Of all the cases who had HDMTX related toxicity, the incidence of hepatotoxity and myelosuppression were the highest. There was no evident relation between MTHFR-C677T and toxicity. Conclusion: Factors related with the metabolism and toxicity of MTX are complicated. The MTHFR gene 677 polymorphism may not serve as predictors of HDMTX related toxicity in children with ALL.

Methylenetetrahydrofolatereductase; Single Nucleotide Polymorphism; Acute Lymphoblastic Leukemia; Methotrexate; Adverse Reaction

2016- 02- 18

2016- 05- 26

廖 静(1981-)，女，四川人，研究生，主治医师，主要研究方向：儿童血液肿瘤。

R733.71; R730.53

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.03.003