苦丁茶冬青粗多糖的分离表征及其抗氧化活性研究

朱科学 朱红英 贺书珍 张彦军 谭乐和 马帅

摘 要 水提醇沉法分离制备苦丁茶冬青粗多糖样品，对其进行初步分离表征（包括总糖、糖醛酸、蛋白质、氨基酸含量和红外光谱分析）和体外抗氧化活性（清除DPPH·自由基、·OH自由基清除能力和还原能力）研究。结果表明，苦丁茶冬青粗多糖中总糖含量为30.67%、糖醛酸含量为12.72%、蛋白质含量为9.35%；含有16种氨基酸成分，总含量为7.72%，其中含有7种人体必需氨基酸，占氨基酸总量的40.41%；红外光谱显示该粗多糖样品中含有α-吡喃糖环结构；此外，苦丁茶冬青粗多糖具有较强的体外抗氧化活性，且其抗氧化活性与多糖浓度之间存在良好的量效关系。

关键词 苦丁茶冬青；多糖；结构；抗氧化作用

中图分类号 TS272 文献标识码 A

Abstract Polysaccharides of Ilex kudingcha C.J. Tseng were obtained by hot water extraction and alcohol sedimentation. The physico-chemical （total sugar， uronic acid and protein） and antioxidant capacity（DPPH radical scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity and reducing power）of polysaccharides isolated from Ilex kudingcha C.J. Tseng. Polysaccharides were isolated sequentially using the Sevag method， ethanol grade precipitation and dried in a lab scale vacuum freeze dryer. The results indicated that the total sugar， uronic acid and protein contents of polysaccharides isolated from Ilex kudingcha C.J. Tseng were of 30.67%， 12.72% and 9.35%， respectively. The polysaccharides also contained 16 general amino acids （7.72%） with 7 essential amino acids. In IR spectra， characteristic absorptions range from 855 to 810 cm-1 were observed， indicating the α-configuration of the sugar units. The polysaccharides also exhibited strong scavenging activities on DPPH free radicals， hydroxyl radicals （·OH） and reducing-antioxidant power， and the antioxidant activity was significantly correlated with its concentration.

Key words Ilex kudingcha C.J. Tseng；Polysaccharides；Structure；Antioxidant capacity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.027

苦丁茶冬青（Ilex kudingcha C.J. Tseng）是冬青科（Aquifoliaceae）冬青属常绿乔木。苦丁茶冬青含有丰富的氨基酸、维生素、黄酮、多酚、微量元素、多糖等多种营养物质，具有降血压、降血脂、抗氧化、免疫调节和抗衰老等功效[1-2]。因此，人们常将苦丁茶作为保健茶、美容茶、减肥茶、降压茶和益寿茶，有“绿色黄金”之美誉，是一种具有广阔开发利用前景的自然资源。

以往对苦丁茶冬青活性成分的研究主要集中在多酚和黄酮类物质的分离、鉴定等方面，孙怡等[3]利用HPLC-DAD、质谱（MS）和核磁共振（NMR）技术分析发现：苦丁茶冬青的主要多酚类化合物为绿原酸及其衍生物。Liu等[4]研究发现，苦丁茶中咖啡酰奎宁酸具有良好体外抗氧化活性。陈志伟等[5]利用微波辅助提取苦丁茶总黄酮，并以总黄酮提取率为指标对提取条件进行优化。

近年来，多糖（Polysaccharides）作为由醛基和酮基通过苷键连接的天然活性大分子物质，已引起越来越多的关注[6]。Fan等[2]研究发现，苦丁茶冬青粗多糖具有良好的体外抗氧化活性和肝脏氧化损伤保护作用。何玲玲等[7]采用乙醇脱脂、水提取及80%乙醇沉淀的方法，从苦丁茶冬青叶中分离得到苦丁茶冬青叶粗多糖，通过比色法发现苦丁茶冬青多糖总糖含量为39.01%，蛋白质含量为5.16%，表明苦丁茶多糖是一种糖蛋白化合物。然而，有关苦丁茶多糖理化性质（包括总糖、糖醛酸、蛋白质、氨基酸种类及含量）、红外光谱分析及其抗氧化特性缺乏系统研究。因此，笔者采用水提醇沉法制备苦丁茶冬青粗多糖，检测其总糖、糖醛酸、蛋白质含量和氨基酸组分，利用红外光谱进行分离表征和评价其体外抗氧化活性（DPPH·自由基、·OH自由基清除能力和还原能力），旨在为中国海南苦丁茶冬青资源的高效、综合开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料和试剂 苦丁茶冬青，由海南兴科热带作物工程技术有限公司提供。

葡萄糖标品和DPPH购自美国Sigma公司；没食子酸、KBr为光谱级试剂，购自阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚购自上海荔达生物科技有限公司；苯酚、浓硫酸为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、无水乙醚均为分析纯试剂，购自西陇化工股份有限公司；邻菲罗啉、硫酸亚铁、三氯乙酸、抗坏血酸等均为国产分析纯试剂。

1.1.2 仪器设备 ME4002E电子天平购自梅特勒-托利多（METTLER-TOLEDO）国际股份有限公司；旋转蒸发仪RV10购自艾卡（广州）仪器设备有限公司（IKA 中国）；SHB-IIIB循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司；LXJ-IIB多管离心机购自上海安亭科学仪器厂；JDG-0.2真空冷冻干燥机购自兰州科近真空冻干技术有限公司；SPECORD 250 PLUS紫外可见分光光度计购自德国耶拿分析仪器股份公司（Analytik Jena AG）；Nicolet FT-IR 5700傅立叶红外光谱仪购自美国赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 苦丁茶冬青粗多糖制备 苦丁茶冬青粗多糖的提取分离参照文献[2， 7]方法，稍加改进：称取苦丁茶冬青叶100 g，粉碎机粉碎，80%乙醇-水（V/V）4 ℃浸泡24 h，除去色素、单糖、寡糖等物质，过滤并进行真空冷冻干燥。按照1 ∶ 20加入蒸馏水后90 ℃提取2 h，3 000 r/min离心10 min，收集浸提液，旋转蒸发进行浓缩。加入3倍体积无水乙醇4 ℃沉淀过夜，5 000 r/min离心10 min 收集苦丁茶冬青粗提物。苦丁茶冬青粗提物挥干乙醇后蒸馏水复溶，以Sevag（氯仿 ∶ 正丁醇为4 ∶ 1，V/V）法进行脱蛋白处理，重复3次，然后用流动自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h，透析液真空浓缩后按比例加入无水乙醇（浓缩液 ∶ 无水乙醇=1 ∶ 4），于4 ℃冰箱中醇沉过夜，5 000 r/min离心10 min，滤渣依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤2次，真空冷冻干燥制备苦丁茶冬青粗多糖。

1.2.2 苦丁茶冬青粗多糖中总糖含量分析 苦丁茶冬青粗多糖中总糖含量的测定参照文献[8]方法并稍作改进：称取干燥的苦丁茶冬青粗多糖样品用超纯水配成溶液（0.1 mg/mL），取2.0 mL苦丁茶冬青粗多糖溶液，加入1.0 mL 5%苯酚溶液后摇匀，沿管壁缓慢加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置30 min后于490 nm波长处测定吸光度，以超纯水作为空白对照。采用葡萄糖标品建立标准曲线，计算总糖含量。

1.2.3 苦丁茶冬青粗多糖中糖醛酸含量分析 采用硫酸-咔唑比色法[9-10]，以葡萄糖醛酸为标品测定苦丁茶冬青粗多糖中糖醛酸的含量。

1.2.4 苦丁茶冬青粗多糖中蛋白质含量分析 采用考马斯亮蓝G-250染色法对苦丁茶冬青粗多糖中蛋白质含量进行测定[11-12]，称取牛血清蛋白标准品用超纯水配制1 mg/mL母液，往母液中加入超纯水配制一组浓度为0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL的牛血清蛋白标准溶液。

称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100 mL，最后用超纯水定容到1 000 mL。

精确移取蛋白质标准溶液和苦丁茶冬青粗多糖溶液（0.1 mg/mL）各1.0 mL，向各管中加入5 mL的考马斯亮蓝G-250溶液，混合均匀，于室温条件下反应10 min，以超纯水为空白，于595 nm波长下测定其吸光度，根据标准曲线计算样品中的蛋白浓度。

1.2.5 氨基酸含量检测 参照本团队建立的分析方法[13]，采用德国Sykam（赛卡姆）S-433D型氨基酸分析仪进行测定。

1.2.6 红外光谱分析 称取苦丁茶冬青粗多糖真空冷冻干燥粉末1～2 mg，与光谱级KBr混合研磨成细小颗粒，压制成透明薄片，在波数为400～4 000 cm-1范围内扫描其红外光谱图。

1.2.7 苦丁茶冬青粗多糖对DPPH·的抗氧化作用

称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液，取0.1 mL不同浓度的苦丁茶冬青粗多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL），加入3.0 mL DPPH溶液，混合均匀，暗室放置30 min，于517 nm处测定吸光度，以抗坏血酸（Vc）作为阳性对照。样品对DPPH·自由基的清除率用公式（1）计算：

清除率/%=[（Ac-Ai）/Ac]×100 （1）

其中，Ai为样品吸光度；Ac为空白对照吸光度（用蒸馏水代替样品）

1.2.8 苦丁茶冬青粗多糖清除羟基自由基（·OH）能力的测定 参照文献方法[14]，样品组、空白组和对照组中依次加入1.0 mL磷酸盐缓冲液（PBS， pH7.4，0.4 mol/L），1.0 mL邻菲罗啉（2.5 mmol/L），试液1.0 mL，1.0 mL硫酸亚铁（2.5 mmol/L），混匀后加入0.5 mL 0.01%H2O2；空白组用1.0 mL超纯水代替样品溶液；对照组用1.5 mL超纯水代替样品溶液和H2O2，37 ℃水浴反应60 min后测定536 nm处的吸光度值，以抗坏血酸（Vc）作为阳性对照。按照公式（2）计算羟基自由基（·OH）的清除率：

清除率/%=[1-（A2-A1）/（A0-A1）]×100 （2）

式中A0为对照组吸光度值，A1为空白组吸光度值，A2为样品组吸光度值

1.2.9 苦丁茶冬青粗多糖还原力的测定 取0.4 mL不同浓度样品溶液，加入0.8 mL 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.6）以及0.8 mL 1% K3Fe（CN）6，摇匀，50 ℃反应20 min，而后加入0.8 mL 10% 三氯乙酸（W/V），混合后5 000 r/min离心10 min。取2.0 mL上清液，加入2.0 mL超纯水和0.5 mL 0.1%（W/V） 三氯化铁（FeCl3），室温下反应10 min，吸光度于700 nm处测定，抗坏血酸用作阳性对照[15]。

1.3 数据分析

试验实验数据采用软件SPSS Statistics 17.0进行分析，并采用Origin 7.5绘制图形。

2 结果与分析

2.1 苦丁茶冬青粗多糖总糖、糖醛酸、蛋白质含量分析

图1-A显示，苯酚-硫酸法作出葡萄糖标准曲线，得回归方程y=0.012 9x+0.042 1，R2=0.996 3。苦丁茶冬青粗多糖在浓硫酸作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色液体，根据490 nm处吸光度平均值，计算得苦丁茶冬青粗多糖总糖含量为30.67%。

硫酸-咔唑比色法是根据糖醛酸与咔唑溶液发生缩合反应生成紫红色化合物，其最大吸收波长为520 nm，以葡萄糖醛酸/半乳糖醛酸为标准品，计算多糖样品中糖醛酸含量。图1-B以不同浓度葡萄糖醛酸作标准曲线，得回归方程y=0.005 4x+0.194 0，R2=0.976 7。通过回归方程计算出苦丁茶冬青粗多糖中糖醛酸含量为12.72%。

考马斯亮蓝法测定苦丁茶冬青粗多糖中蛋白质的含量，以牛血清蛋白为标准，标准曲线如图1-C所示，得回归方程y=0.002 4x+0.043 9，R2=0.998 5。计算得苦丁茶冬青粗多糖中蛋白含量为9.35%。

2.2 苦丁茶冬青粗多糖氨基酸含量分析

图2-A和图2-B分别为18种标准氨基酸的分离色谱图和苦丁茶冬青粗多糖中氨基酸的分离色谱图。如表1所示，苦丁茶冬青粗多糖中含有16种氨基酸成分，总含量为7.72%，含量较高的有天冬氨酸（Asp）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）。其中，苦丁茶冬青粗多糖中含有7种人体必需氨基酸，占氨基酸总量的40.41%，分别为苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）和赖氨酸（Lys）。

2.3 红外光谱分析

图3为苦丁茶冬青粗多糖的红外光谱图，苦丁茶冬青多糖具有一般多糖在红外光谱中的特征：红外图谱在3 372 cm-1处吸收峰为O-H的伸缩振动或N-H的伸缩振动，2 926 cm-1处为-CH2的C-H伸缩振动，这两组吸收峰可以确定该类物质为多糖类化合物；1 639 cm-1处吸收峰为C=C键的伸缩振动，1 440 cm-1处是羧基（-C-O-O-H）的C-O伸缩振动引起的吸收峰，1 200～1 400 cm-1 处为C-H的弯曲振动，1 077 cm-1处吸收峰为C-O键（C-O-H， C-O-C）的伸缩振动，855-810 cm-1 处显示吡喃糖α-端基差向异构的C-H变角振动。

2.4 DPPH·清除能力

如图4所示，苦丁茶冬青粗多糖清除DPPH·自由基的能力随着多糖浓度的增加而增强，当苦丁茶冬青粗多糖的浓度达到2 mg/mL时，清除能力趋于稳定，达到72%。然而，同等浓度条件的抗坏血酸清除能力均为90%以上。

2.5 羟基自由基（·OH）清除结果

由图5可知，苦丁茶冬青粗多糖对·OH清除能力较好，0.5 mg/mL浓度时，即显示较强清除羟自由基的能力。其清除作用随着多糖浓度的升高也逐渐加强，呈量效关系，但其清除能力比同浓度Vc的清除能力低。

2.6 还原能力分析

700 nm波长处测定吸光度高低可反映还原能力强弱，吸光度越高，还原力越强。图6可以看出，苦丁茶冬青粗多糖的还原能力，在一定浓度范围（0.25～1.0 mg/mL）随着浓度的增加而增大，其效果与浓度呈正相关性；当浓度高于1.0 mg/mL时，其还原能力保持恒定。

3 讨论与结论

多糖是苦丁茶冬青叶中一种极具开发价值的生物活性物质，Fan等[2]对苦丁茶冬青水提物进行DEAE-52纤维素阴离子交换色谱层析，结果发现苦丁茶冬青粗多糖样品中总糖含量为61.3%，糖醛酸含量为21.8%，蛋白质含量为5.8%。笔者采用苯酚-硫酸法测得苦丁茶冬青粗多糖中总糖含量为30.67%；通过考马斯亮蓝分析发现蛋白质含量为9.35%；硫酸-咔唑比色法测得苦丁茶冬青粗多糖的糖醛酸含量为12.72%。本实验制备的苦丁茶冬青粗多糖需进一步纯化。

氨基酸是构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动密切相关，是生物体内不可缺少的营养成分。苦丁茶冬青中含有多种氨基酸，梁远发等[16]研究发现，苦丁茶中氨基酸由16种水解氨基酸组成含有7种人体必需氨基酸和1种婴儿必需氨基酸。本研究结果发现：苦丁茶冬青粗多糖中含有16种氨基酸成分，总含量为7.72%，含有7种人体必需氨基酸，占氨基酸总量的40.41%，反映出苦丁茶冬青中游离氨基酸含量低，水解氨基酸含量较高。

抗氧化物质及其抗氧化活性在营养学、医学领域越来越受到关注。大量研究表明，天然产物多糖是一种具有抗氧化活性的生物活性物质[17-18]。赵天湖等[19]发现，大叶冬青苦丁茶粗多糖及其纯化多糖均对DPPH·、O2·- 和·OH有一定的清除作用，具有较强的还原能力与螯合金属离子能力。吴晓鹏等[20]选用粗多糖A、DEAE-52纤维素柱分离物K1和葡聚糖凝胶G-100分离物K3 3种苦丁茶多糖进行抗氧化活性研究发现，3种多糖对O2·- 、·OH和DPPH·自由基具有一定的清除作用；同时，对H2O2诱导红细胞氧化溶血反应和红细胞自氧化溶血反应都有显著的抑制作用。本研究结果显示，苦丁茶冬青粗多糖对DPPH·自由基和·OH自由基的清除能力随着多糖浓度的升高也逐渐加强，呈现量效关系，与上述研究结果相一致。

苦丁茶冬青粗多糖可作为一种外源性抗氧化剂，在生物体内直接参与猝灭自由基，能增强机体防御毒性自由基损伤的能力，从而避免或减缓自由基对机体的损伤，在抗氧化和抗衰老方面具有广阔的应用前景。但关于苦丁茶冬青多糖的结构与其抗氧化能力的关系有待于进一步的研究。

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