南繁区棉花炭疽病菌生物学特性研究

刘文波　李平　邬国良　林春花　缪卫国　郑服丛

摘 要 研究南繁区棉花炭疽病菌的生物学特性为筛选其杀菌剂提供理论依据。从海南省南繁棉花区采集病样分离得到病原菌，对病原菌进行生物学特性研究。结果表明：棉花炭疽病菌（HNNC8）菌丝在PDA培养基上生长最好；菌丝生长和孢子萌发的最适温度分别为25和30℃；最适pH值分别为7～9和6～8；连续黑暗条件较适合菌丝生长；菌丝在以麦芽糖、阿拉伯糖为碳源的培养基上生长最好；在以蛋白胨为氮源培养基上生长最好；病菌分生孢子致死温度为 55℃水浴处理 5 min。温度过高或过低酸性环境都会影响菌丝生长和分生孢子的萌发，且不同的碳源、氮源亦会影响病菌菌丝的生长。

关键词 棉花 ；棉花炭疽病菌 ；生物学特性

分类号 435.621.2+2 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.011

Abstract The paper was to study the biological characteristics of Colletotrichum gossypii in Hainan， and preliminarily screen its fungicides. The pathogen was isolated from the infected leaves of cotton collected from breeding in Hainan province， The biological characteristics of C. gossypii. The mycelium had the best growth on the medium with Potato Dextrose Agar. The optimum temperature for mycelial growth and spore germination were 25 and 30℃，and the optimum pH was 7～9 and 6～8， respectively. The continuous dark condition was more suitable for mycelial growth. The suitable carbon sources were maltose， L-arabinose， and the suitable nitrogen sources were peptone. The lethal temperature of spore was 55 ℃ water bath for 5 min. Temperature too high or too low， acidic environment will affect the mycelial growth and spore germination， and different carbon sourceor nitrogen source， will also affect the growth of hypha.

Keywords cotton ； Colletotrichum gossypii Soutllw. ； biological characteristics

棉花是锦葵科（Malvaceae）棉属（Gossypium）植物，该属约含50个种[1]，是世界性重要经济作物，目前，全世界种植棉花的国家和地区有96个[2]。棉花也是我国重要的经济作物，不仅涉及到农业和纺织业，而且是中国农民重要的收入来源，也是我国外贸出口的主要商品之一。近年来，随着海南省南繁区棉花育种需求量的不断增加，使该地区棉花生产中的病害问题也日趋凸显，由棉花炭疽菌（Colletotrichum gossypii Soutthw.）引起的棉花炭疽病是棉花产业发展的限制因素之一。棉花炭疽病在棉花整个生育期均可以发生，主要为害棉苗和棉铃，在多雨潮湿、低温时容易发病，温度和湿度是影响发病的重要原因[3]。Miller[4]和Hansford[5]认为，多雨高湿是炭疽病菌侵染棉花的重要因素。铃期高温多雨及苗期低温多雨都易导致炭疽病流行[6]。为此，本实验室在海南省三亚市中国农科院棉花研究所基地、新疆农科院三亚棉花基地、三亚藤桥棉花基地及陵水棉花地采集棉花病样分离得到病原菌，对该病原菌进行了生物学特性研究，为棉花田间的生产、防治棉花炭疽病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

菌株：2014年9～12月在海南省三亚市中国农科院棉花研究所基地、新疆农科院棉花基地、三亚藤桥棉花基地及陵水棉花地采集棉花病样分离得到病原菌，按照常规方法进行组织分离培养并经单孢纯化得到10株菌，编号为HNNC1～10， 通过形态学鉴定、柯赫氏法则及ITS鉴定，确定为棉花炭疽菌（C. gossypii Southw） ，PDA 斜面保存。

1.1.2 供试药剂

D-（+）-木糖（广州化学试剂厂），麦芽糖（广州化学试剂厂），阿拉伯糖（广州化学试剂厂），葡萄糖（广州化学试剂厂），乳糖，D-（+）-半乳糖（广州化学试剂厂），淀粉（北京索莱宝），硫酸铵（广州西陇化工），硝酸铵（广州西陇化工），甘氨酸（广州西陇化工），蛋白胨（广州西陇化工），酵母浸膏（北京索莱宝），牛肉浸膏（北京索莱宝），尿素（广州西陇化工）。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬浮液的制备

5 mL灭菌水洗脱培养6 d的病原菌，制成10×40倍镜视野下 20～30个孢子浓度的悬浮液。

1.2.2 菌饼的制备

病原菌孢子用无菌水稀释为107个/mL，均匀的涂于PDA平板上， 25℃恒温培养 3 d 后，用直径 4 mm 的打孔器打取菌饼。

1.2.3 致病性测定

参照Viaud等[7]的离体叶片接种法：在磁盘内铺双层滤纸，加少量灭菌水。剪取生长一致的幼嫩棉花叶片，自来水冲洗后，75%的酒精表面消毒 30 s，灭菌水冲洗3遍，吸干叶表水，平铺到磁盘上，用灭菌的针轻轻刺伤棉花叶片，每张叶片刺伤3个点， 用直径为4 mm的打孔器在培养好的不同地点的棉花炭疽菌打取菌饼，接于刺伤叶片上。每片叶接3块菌饼，对照接相同大小的PDA培养基块。用保鲜膜封好，置于25℃恒温光照培养箱内黑暗培养，5 d后调查发病情况。

1.2.4 棉花炭疽病菌DNA提取及ITS鉴定

接棉花炭疽病菌菌块（直径4 mm）于200 mL的马铃薯葡萄糖液体培养基中，在 25℃下150 r/min振荡培养8 d，倒入灭菌的50 mL的离心管，4 500 r/min 离心10 min ，收集各菌株菌丝，液氮速冻，-80℃下保存备用。 提取DNA时取50 mg 菌丝，在液氮中将其研磨成粉末。 DNA的提取方法按照OMGA试剂盒的方法提取[8]，DNA 用浓度测定仪（Bio-rab，美国）测定其浓度。置于冰箱（-20℃）下保存备用。ITS1、ITS4引物在上海生工生物科技有限公司合成。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应程序：参照王芝娜等方法[9]，PCR反应体系（25 μL）：10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL dNTPs（各2.5mmol/L）2 μL；引物ITS1/ ITS4各1 μL；模板DNA 1 μL；dd H2O 17.5 μL。PCR的扩增程序：94℃预变性1 min；94℃变性1 min；57℃退火30 s；72℃延伸1 min；最后72℃延伸7 min；35个循环。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，所得产物经OMEGA胶回收试剂盒回收，连接到TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit载体，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，验证阳性克隆送华大基因公司测序。

1.2.5 棉花炭疽病菌生物学特性研究

1.2.5.1 不同培养基对棉花炭疽菌菌丝生长的影响

培养基包括PDA培养基、PDA+1‰酵母培养基、PSA培养基、PSA+1‰酵母培养基、西瓜肉榨汁培养基、西瓜皮榨汁培养基、玉米粉培养基、燕麦培养基和胡萝卜培养基。将培养好的棉花炭疽菌，用4 mm的打孔器制成的菌饼移入不同培养基平板中央，每种培养基3次重复，置于25℃恒温培养6 d。分别于3和6 d后用十字交叉法测量菌落直径[10]。

1.2.5.2 温度对棉花炭疽菌菌丝生长和孢子萌发的影响

将棉花炭疽菌接种在PDA平板上，分别置于5、10、15、20、25、28、30、35、40℃恒温培养， 培养和测量方法参照“1.2.5.1”。用无菌水稀释已经培养6 d的棉花炭疽菌，用移液枪吸取孢子悬浮液于凹玻片上，置于上述9个温度处理保湿培养，分别于培养6和12 h后，用1%棉蓝乳酚油固定，镜检孢子萌发率（注：分生孢子的萌发以芽管的长度超过分生孢子直径长度的50%为标准），每次检查孢子300个[10]。

1.2.5.3 pH对棉花炭疽菌菌丝生长和孢子萌发的影响

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液，调节PDA培养基的pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10个处理，接棉花炭疽菌于平板中央，培养和测量方法参照“1.2.5.1”。将棉花炭疽菌的孢子悬浮液调节成上述10个pH处理，培养和计数方法参照“1.2.5.2”。

1.2.5.4 光照对棉花炭疽菌菌丝生长的影响

将棉花炭疽菌接到PDA平板上，置于连续光照、光/暗交替和连续黑暗3种光照条件下，培养和测量方法参照“1.2.5.1”。

1.2.5.5 孢子致死温度的测定

用移液枪吸取1 mL棉花炭疽菌的孢子悬浮液于无菌试管内，分别置于40、45、50、55、60 ℃ 恒温水浴锅中，每处理分别保持5、10 min后取出迅速冰浴，将各处理的孢子悬浮液滴加于凹玻片上，培养和计数方法 参照“1.2.5.2”。

1.2.5.6 碳源和氮源对棉花炭疽菌菌丝生长的影响

采用基础培养基（Czapek培养基）[11]，分别用D-（+）-木糖、麦芽糖、阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、D-（+）-半乳糖、淀粉7种碳源等量替换基础培养基中的蔗糖；分别用硝酸铵、硫酸铵、蛋白胨、甘氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、尿素7种氮源等量替换基础培养基中的硝酸钠。将棉花炭疽菌菌饼接种于不同碳源、氮源培养基平板中央，以无菌水培养基为对照。培养和测量方法参照“1.2.5.1”。

1.2.6 数据处理

采用DPS、Excel软件对数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 棉花炭疽病菌的致病性测定

将经过单孢分离纯化后的棉花炭疽菌分别接种到健康棉花叶片上，5 d后观察，接种的叶片可以观察到明显的症状（图1-D），而对照的叶片未发病（图1-C）。从叶片的发病部位分离到与接种菌菌落生长性状和分生孢子形态一致的病原菌（图1-B）。结果6株发病，经过ITS鉴定，其中4株为Colletotrichum gloeosporioide，2株为Colletotrichum gossypii，确定分离到的菌株为棉花炭疽菌。选择致病性强的HNNC8（C. gossypii）菌株做生物学测定。

2.2 棉花炭疽病菌的ITS鉴定

用ITS1、ITS4进行PCR-ITS鉴定。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得约550 bp大小的片段（图2）。经OMEGA胶回收试剂盒回收，连接到TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit载体，转化DH 5α大肠杆菌感受态细胞。每个菌株随机挑取5个白色菌落进行菌落PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。所挑选的转化子均扩增得到550 bp左右的条带（图3），为阳性克隆。

取菌液送往深圳华大基因公司测序，并对测序结果进行分析。经NCBI的Blast搜索，棉花炭疽HNNC8菌株与登录号为JX844099.1菌株相似性达99%。经NCBI的Nucleotide搜索，利用MEGA5.0软件构建系统进化树（表1、图4）。

2.3 棉花炭疽病菌的生物学特性

2.3.1 不同培养基对棉花炭疽菌菌丝生长的影响

实验数据表明，在供试的9种培养基中，棉花炭疽病菌在各种培养基中菌落直径差异比较明显。棉花炭疽病菌菌丝在PDA培养基中生长最好，培养3和6 d后菌落平均直径分别为 4.54和 7.18 cm；其次在PSA培养基中生长也较好，分别为 4.26和 6.88 cm；西瓜皮榨汁培养基、玉米粉培养基和燕麦培养基，培养6 d的菌落平均直径分别为5.98、5.75和5.65 cm；菌丝在胡萝卜培养基、PSA+1‰酵母、西瓜肉榨汁培养基上生长较差，培养6 d的菌落平均直径分别为5.44、5.16和 5.05 cm；菌丝在PDA+1%酵母培养基上生长最差，培养3和6 d的菌落平均直径分别仅为 3.16和4.93 cm（图4、表2）。

2.3.2 温度对棉花炭疽菌菌丝生长和孢子萌发的影响

实验表明，在PDA平板上，棉花炭疽菌的菌丝在15～35℃范围内均能生长，不同温度条件下菌丝生长有差异。随着温度升高，菌丝生长速度加快，25℃的温度最利于菌丝生长，培养6 d的菌落平均直径为8.45 cm，极显著优于其他温度处理；低于15℃或高于30℃时，不利于病菌菌丝生长；低于 10℃或高于 40℃时，病菌菌丝停止生长（图5，表3）。

孢子在10～40℃的温度条件下均可萌发，低于5℃时分生孢子不能萌发，随着温度升高，孢子萌发率也随之升高，28～30℃最适宜孢子萌发，经过12 h培养后，萌发率分别为89%和90%，当温度高于30℃时，孢子萌发率明显降低（图6）。

2.3.3 pH对棉花炭疽菌菌丝生长和孢子萌发的影响

在供试10种不同pH值的PDA培养基中，棉花炭疽病菌在各种培养基中生长存在差异。pH值3～12 时，菌丝均能生长，小于4时菌丝生长明显受到抑制，在7时最适宜菌丝生长，5～12内菌丝生长差别不明显（图7，表4）。

分生孢子在 pH值为 3～12 时均能萌发，最适合分生孢子萌发的 pH 值为 6～8，分生孢子培养12 h 后，其萌发率分别为88%、90%和89%，pH值较高或较低均不利于棉花炭疽菌孢子萌发（图8）。

2.3.4 光照条件对棉花炭疽菌菌丝生长的影响

棉花炭疽菌在不同光照条件下均能生长，连续黑暗条件最利于菌丝生长，培养3和6 d的菌落平均直径分别为 5.01和 8.25 cm；其次为光暗交替条件，培养 3和6 d的菌落平均直径分别为4.75和7.95 cm；连续光照条件下菌落生长最慢，培养3和6 d后，菌落平均直径分别为4.55和7.70 cm（图9，表5）。

2.3.5 棉花炭疽菌孢子的致死温度

棉花炭疽病菌分生孢子在45℃水浴处理10 min后萌发率显著降低。分生孢子经55℃水浴处理5 min后，培养12 h后在显微镜下观察分生孢子，分生孢子无萌发，再经凹玻片保湿培养48 h仍不见萌发，分生孢子丧失活性。从实验可知，棉花炭疽病菌孢子致死温度为55℃水浴处理5 min。

2.3.6 碳源和氮源对棉花炭疽菌菌丝生长的影响 供试的7种碳源中，棉花炭疽病菌在各种碳源中菌落直径差异不大，但麦芽糖、阿拉伯糖作为碳源的培养基较适合病菌菌丝生长，培养6 d的菌落平均直径分别为7.16、7.14 cm；以乳糖、D-（+）-木糖和淀粉为碳源的培养基上菌丝生长较差，培养6 d的菌落平均直径分别为6.85、6.47和6.46 cm；而在以葡萄糖和D-（+）-半乳糖为碳源的培养基上菌丝生长最差（图10，表6）。

供试的7种氮源中，棉花炭疽病菌在各种氮源中菌落直径差异显著。在参试氮源中，病菌菌丝在含蛋白胨的培养基上生长最好，培养3和6 d的菌落平均直径为3.95、8.11 cm；以牛肉浸膏、酵母浸膏和甘氨酸为氮源的培养基菌丝生长较好；而以尿素、硝酸铵和硫酸铵为氮源的培养基不利于菌丝的生长（图11，表7）。

3 讨论与结论

从海南省4个地方采集棉花病样，分离得到10个菌株，经致病性测定及ITS鉴定，确定为棉花炭疽菌的菌株为HNNC5和HNNC8 2个菌株。4株为Colletotrichumg loeosporioide和杨友联等报道一致[12]，从ITS的鉴定表明，棉花炭疽病是由不同的胶孢复合群侵染引起[12]。本实验室选择了致病性最强的HNNC8做生物学特性测定，研究表明，HNNC8菌丝在PDA培养基上生长最好。菌丝在15～35℃范围内均能生长，25℃最适合菌丝生长，孢子萌发的最适温度为30℃。pH值为3～12时菌丝均能生长，pH 值为 7时最适合菌丝生长，最适合孢子萌发的pH 值为6～8。连续黑暗条件下较适合菌丝生长。分生孢子致死温度为55℃水浴处理5 min。供试碳源中，病菌菌丝在含有麦芽糖、阿拉伯糖的培养基上生长较好；供试氮源中，病菌菌丝在含蛋白胨的培养基上生长较好，这与汤吉[13]观点一致。在国内，还鲜少有关棉花炭疽病的生物学特性的报道，笔者认为，温度过高或过低、酸性环境都会影响菌丝生长和分生孢子的萌发，不同的碳源、氮源亦会影响病棉花炭疽菌菌丝的生长。详细了解棉花炭疽病菌的生物学特性，对生产中预防该病的发生具有指导作用。

海南省南繁育种基地具有独一无二的气候资源[14]，海南省已成为我国最大的种子、苗木等育种基地。南繁育种主要是在海南的冬天进行，这时的天气温度在10～28℃，而且湿度比较大。特别适合南繁区棉花炭疽病的发生[15]，给棉花育种上造成的危害和损失不容忽视。该研究结果为南繁区棉花炭疽病的防治奠定病原学基础。

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