一株拮抗香蕉枯萎病菌内生细菌的抑菌机制研究

刘先宝　蔡吉苗　陈奕鹏　黄贵修

摘 要 采用生物化学方法，分析了一株香蕉内生细菌BEB99发酵液的乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌4号小种（FOC4）的抑菌机制，结果表明，其对香蕉枯萎病菌菌丝脂质过氧化、麦角甾醇含量、蛋白质含量及果胶酶活性均有一定的影响，但不能产生几丁质酶。

关键词 内生细菌 ；劳尔氏菌 ；尖孢镰刀菌；抑菌机制

分类号 S432.4+2 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.010

Abstract The antagonistic mechanisms of ethyl acetate crude extract of BEB99 strains for Fusarium oxysporium were studied by biological chemical method. The results revealed that ethyl acetate crude extract could influence lipid peroxidation， ergosterol content， protein content， the activity of PMG of Fusarium oxysporum. But it could not decompose the chitin.

Keywords Endophytic bacteria ； Ralstonia sp. ； Fusarium oxysporum ； antimicrobial mechanism

植物内生细菌是指生活于植物的组织和器官内部而不引起症状的细菌，其中很多菌种在病害生物防治和促进植物生长发育等方面具有潜在的应用价值[1]。内生细菌的生防机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导抗性，其中拮抗作用是生防菌主要的抗菌机制。生防菌产生的拮抗物质主要包括细胞壁降解酶类，如几丁质酶或葡聚糖酶、抗菌蛋白、抗菌肽和挥发性物质等[2]。

香蕉是中国重要的热带经济作物。由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性的土传病害。已有研究表明，利用内生细菌生物防治香蕉枯萎病具有较好的防治效果[3]。本实验室以香蕉枯萎病菌为指示菌，经筛选获得一株具有抑菌活性的内生细菌BEB99，该菌株经鉴定为劳尔氏菌（Ralstonia sp.），其发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均具有明显的抑制作用，可造成病菌菌丝的畸形，抑制孢子萌发。为进一步了解该菌对香蕉枯萎病菌的作用机制，笔者研究了该菌发酵液的乙酸乙酯粗提物对菌丝脂质过氧化、麦角甾醇含量、蛋白质含量及果胶酶活性的影响，以期为该菌株下一步的应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

香蕉内生细菌BEB99和香蕉枯萎病病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种（Fusarium oxysporium f. sp. cubense （Smith） Snyder & Hansen race 4， FOC4）均由本实验室分离和保存。

1.1.2 培养基和试剂

NA培养基、优化培养基（4 g/L葡萄糖，1 g/L酸水解酪蛋白，0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2，1 ml/L的1 mol/L CaCl2，pH 6.5）、PDA培养基、PDB培养基、乙酸乙酯、几丁质培养基（胶状几丁质15 g，酵母膏3 g，KH2PO4 1.36 g，NH4SO4 1 g，MgS04·5H2O 0.3 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 BEB99菌株发酵液制备

将保存的内生细菌BEB99菌株接种于优化平板培养基中，于28℃中活化24 h；将活化的BEB99菌株接入50 mL优化的液体培养基中（150 mL三角瓶），于28℃、180 r/min条件下振荡培养36 h，制成种子液；再将种子液以7%的接种量接入优化培养液中，于相同条件下培养36 h，制备BEB99菌株的发酵液。

1.2.2 BEB99菌株发酵产物分离

将浓缩的发酵产物用细胞超声破碎仪破碎后，用250 mL乙酸乙酯有机溶剂与发酵液等体积混合，在1 000 mL分液漏斗中反复颠倒振荡30 min，使其萃取充分，静置过夜，萃取3次，合并有机相，将有机相减压浓缩成浸膏，用乙酸乙酯溶剂定容，备用。

1.2.3 菌丝体处理方法

将FOC4分生孢子悬浮液接种于50 mL PDB中（分生孢子最终浓度为1×107 个/mL），于28 ℃静置培养5 d；加入乙酸乙酯相提取物使其终浓度分别为50、100、150 μg/mL，继续静置培养5 d；用滤纸过滤备用。

1.2.4 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝脂质过氧化影响测定

参照赵世杰等[4]的方法测定菌株BEB99乙酸乙酯相提取物对FOC4菌丝细胞膜脂质过氧化的影响。

1.2.5 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝麦角甾醇影响测定

参考韩平等[5]的方法测定抑菌物质对菌丝细胞膜组成成分麦角甾醇的影响。

1.2.6 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝蛋白质含量影响测定

参照何璐[6]的方法测定BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝蛋白质含量的影响

1.2.7 BEB99菌株发酵产物对FOC4病菌胞外果胶酶活性影响测定

参照何璐[6]的方法测定BEB99菌株发酵产物对FOC4病菌果胶酶活性的影响。

1.2.8 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌株几丁质影响测定

将几丁质培养基倒平板后，把牛津杯插入平板中央，吸取20 μL乙酸乙酯相提取物加入牛津杯中，以乙酸乙酯溶剂为对照，3次重复；于28℃中培养3 d，观察牛津杯周围是否有透明圈。

2 结果与分析

2.1 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝脂质过氧化的影响

丙二醛（MDA）是细胞膜脂质过氧化的产物，其含量高低表示细胞膜受损害程度。由表1可看出，经菌株BEB99乙酸乙酯相提取物处理后，FOC4菌丝体细胞膜的脂质过氧化产物丙二醛含量增加，均显著高于对照，且不同处理间也存在显著差异。随着活性产物提取物浓度的升高，丙二醛含量逐渐上升，表明随着抑菌物质浓度的升高，病原菌细胞膜受到损害的程度越来越大。

2.2 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝麦角甾醇含量的影响

麦角甾醇是菌体细胞膜上的重要组成物质。菌株BEB99乙酸乙酯相提取物对麦角甾醇含量的影响结果见表2，随着活性产物提取物浓度的升高，麦角甾醇的含量不断增加，显著高于对照，并且不同处理间也存在显著差异。说明BEB99乙酸乙酯相提取物是抑制香蕉枯萎病菌的作用物质之一。

2.3 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌丝蛋白质含量的影响

绘制牛血清蛋白标准曲线（图1），标准曲线为y=0.003 x+0.122，R2=0.947。

样品溶液蛋白质含量测定结果见表3，用不同浓度的菌株BEB99乙酸乙酯相提取物处理相同质量的FOC4菌丝后，各处理样品的蛋白质含量随活性产物提取物浓度的增大而降低，当提取物浓度为100、150 μg/mL时，蛋白质的含量不存在显著差异，但不同处理均与对照之间存在显著差异，说明提取物对FOC4菌丝中蛋白质的含量影响显著。

2.4 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌株胞外果胶酶活性的影响

绘制葡萄糖标准曲线（图2），标准曲线为y=0.869 x-0.028，R2=0.998。

在540 nm处测得的OD值如表4所示，在葡萄糖标准曲线上查得还原糖含量，进而计算出果胶酶的活性。各处理样品的果胶酶活性随乙酸乙酯相提取物浓度的增大而略有降低，且均显著低于对照，同时不同处理间也存在显著差异，说明提取物对FOC4菌丝中果胶酶的合成存在显著影响。

2.5 BEB99菌株发酵产物对FOC4菌株几丁质的影响

几丁质在培养基上呈白色不溶性微粒状，在几丁质水解酶的作用下被水解成可溶性的小分子，呈透明状。取20 μL乙酸乙酯相提取物注入牛津杯，在几丁质培养基上培养3 d后发现，牛津杯周围未出现透明的水解圈，即菌株BBE99乙酸乙酯相提取物不能水解病原菌细胞壁结构的组成成分几丁质。

3 讨论

目前，有关生防内生菌抗菌机制的研究大部分仅限于其对病原菌活体的防效及其对菌丝生长、孢子形成和萌发的影响，对于其毒理作用涉及较少[7]。本研究分析了菌株BEB99的乙酸乙酯相提取物对FOC4菌丝细胞组成和代谢的影响。脂质和麦角甾醇是细胞膜的主要组成部分，脂质过氧化反映了细胞膜受损害的程度，而丙二醛是脂质过氧化的产物。研究发现，随着菌株BEB99的乙酸乙酯相提取物浓度的升高，细胞膜的脂质过氧化增强（即脂质过氧化产物丙二醛含量增加），麦角甾醇含量增加，表明损坏细胞膜结构是菌株BEB99抑制香蕉枯萎病菌的作用方式之一，这与王芳[7]提出的作用机制（内生枯草芽抱杆菌抗菌物质与病原菌细胞膜上的卵磷脂类物质结合形成复合体导致膜的穿孔，从而破坏串珠镰刀菌质膜）不同。几丁质是真菌细胞壁的重要组成物质。本研究发现，菌株BEB99乙酸乙酯相提取物不能产生几丁质酶来水解几丁质或者破坏几丁质的合成，而其对香蕉枯萎病菌细胞壁其他组成物质是否有影响还需进一步研究。

在菌株BEB99抗菌物质影响病原菌菌体细胞内代谢物质的合成方面，研究了其对香蕉枯萎病菌菌丝体中蛋白质含量的影响，结果表明，利用不同浓度的菌株BEB99乙酸乙酯相提取物处理相同质量的FOC4菌丝后，各处理样品的蛋白质含量随提取物浓度增大而降低，当提取物浓度为100、150 μg/mL时，蛋白质的含量不存在显著差异，但各处理均与对照之间存在显著差异，说明菌株BEB99乙酸乙酯相提取物对FOC4菌丝中蛋白质的含量存在显著影响。董章勇等[8]提出，果胶酶是香蕉枯萎病菌的主要致病毒力因子。本研究发现，供试菌株的乙酸乙酯相提取物对香蕉枯萎病菌合成的果胶酶具有显著影响，随着其浓度的升高，果胶酶活性显著降低，这将降低病原菌致病毒力，这与王芳[7]提出的的抗菌物质对番茄叶霉病菌胞外酶活性的抑制效果相一致。综合本研究的结果可知，菌株BEB99乙酸乙酯相提取物能够抑制香蕉枯萎病病原菌的菌丝果胶酶活性和蛋白质的含量，并通过破坏细胞膜结构产生抑菌作用，而抗菌物质对病菌菌丝细胞壁的组成物质几丁质没有影响，其作用机理的研究可为更加有效地应用菌株BEB99奠定基础，在实践上具有重要的应用价值，值得进一步开发利用。

参考文献

[1] Jesús Mercado-Blanco， Ben J J. Lugtenberg. Biotechnological Applications of Bacterial Endophytes[J]. Current Biotechnology， 2014， 3（3）： 60-75.

[2] Ryan R P， Germaine K， Franks A， et al. Bacterial endophytes： recent developments andapplications[J]. FEMS Microbiol Lett， 2008， 278（1）： 1-9.

[3] Ting A S Y， Meon S， Kadir J， et al. Endophytic microorganisms as potential growth promoters of banana[J]. BioControl， 2008， 53（3）： 541-553.

[4] 赵世杰，许长成，邹 琦，等. 植物组织中丙二醛测定方法的改进[J]. 植物生理学通讯，1991，30（3）：207-210.

[5] 韩 平，刘西莉，刘鹏飞，等. 高效液相色谱法研究啶菌恶唑对番茄灰霉病菌麦角甾醇生物合成的影响[J]. 分析化学，2006，10（2）：78-82.

[6] 何 璐. 苦参内生真菌抑菌物质纯化鉴定及作用机制研究[D]. 沈阳： 沈阳农业大学， 2011.

[7] 王 芳. 苦参内生拮抗细菌筛选及其抗菌物质纯化鉴定[D]. 沈阳：沈阳农业大学，2009.

[8] 董章勇，王 琪，秦世雯，等. 香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种细胞壁降解酶的比较[J]. 植物病理学报，2010，40（5）：463-468.