国内橡胶树多主棒孢Cassiicolin毒素多样性及致病性分析

刘先宝 李博勋 陈珊 黄贵修

摘 要 由多主棒孢引起的棒孢霉落叶病是橡胶树的主要叶部病害，cassiicolin毒素是病菌的主要致病因子。本研究通过ITS序列分析对供试多主棒孢菌株进行了准确鉴定，利用cassiicolin毒素不同亚型编码基因特异引物对不同地理来源和寄主来源的49个多主棒孢菌株毒素类型进行了分析，并利用生物萎蔫法对不同亚型毒素进行了致病性分析。结果显示，78%供试菌株含有cassiicolin基因，其中Cas2亚型有10个菌株，Cas5亚型有28个菌株，其它为Cas0型（未检测到cassiicolin毒素基因）。含有Cas5亚型的菌株均来源于橡胶树，并且为橡胶树上的优势群体；Cas2亚型菌株则来源于橡胶树、黄瓜、番木瓜和木薯等不同作物；Cas2和Cas5毒素对不同橡胶树品种的致病性存在明显差异。

关键词 橡胶树；多主棒孢；毒素；致病性

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Corynespora leaf fall （CLF） disease causing by Corynespora cassiicola is a very severe disease in rubber tree（Hevea brasiliensis）. A small secreted glycoprotein named cassiicolin was previously described as an important effect of C. cassiicola，which was able to induce disease symptoms on the host plant leaves. In this study，the diversity of the cassiicolin-encoding gene was analyzed using 49 C. cassiicola isolates sampled from various hosts and geographical origins in China. The cassiicolin gene was detected in 78% of the isolates， encoding up to 2 distinct protein isoforms（Cas2 and Cas5）. Twenty eight isolates carrying the Cas5 encoding gene（toxin class Cas5） were found in the dominant group in rubber tree in China，and only were found in the isolates from rubber tree. Ten isolates representative of the toxin class Cas2 were collected from rubber trees and other host plants including cucumber，papaya and cassava. The difference between Cas2 and Cas5 cassiicolin was very significant in pathogenicity profiles.

Key words Rubber tree；Corynespora cassiicola；Cassiicolin；Pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.020

由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的橡胶树棒孢霉落叶病（Corynespora leaf fall disease，CLFD）成为亚洲和非洲等天然橡胶产区最具破坏性的病害之一。该病在橡胶树的各个生理期发生，在危害叶片上可表现出多种不同症状，引起橡胶树反复落叶、树冠稀疏，影响幼苗和幼树生长，降低开割树产胶量[1]。据报道，橡胶树多主棒孢寄主选择性毒素cassiicolin是该病原菌的主要致病因子。Breton等[2]首次从橡胶树多主棒孢的培养滤液中分离纯化到了寄主选择性毒素，利用毒素抗体和纯毒素证实了寄主选择性毒素cassiicolin在多主棒孢致病过程中的作用。该毒素是一种通过毒素蛋白前体（pro-cassiicolin）剪接得到的小蛋白，与其它由核糖体合成的寄主选择性毒素蛋白不具有同源性，是一种新型结构毒素蛋白，具有与其它毒素蛋白不同的致病机制，病原菌与寄主间存在新的互作关系[3-5]。

近年来，研究人员在多主棒孢中先后发现了多个cassiicolin的亚型。刘晓妹[6]在中国橡胶树多主棒孢中发现了Cas2亚型cassiicolin编码基因。2012年，Déon等[7]从橡胶树内生多主棒孢菌株中发现了编码Cas3和Cas4亚型的Cas3和Cas4基因。2014年，Déon等[8]对多主棒孢cassiicolin编码基因多样性进行了研究，发现了2个新亚型基因Cas5和Cas6，明确了多主棒孢存在6个毒素亚型。具有Cas1亚型的菌株致病性最强，主要分布在菲律宾和喀麦隆、加纳等非洲国家；Cas2 和Cas6亚型菌株来源于国外非橡胶树作物；Cas3和 Cas4亚型均来自巴西橡胶树内生多主棒孢菌株；Cas5亚型菌株则来源于马来西亚、斯里兰卡等亚洲国家的橡胶树。还有一些橡胶树多主棒孢菌株中未检测到cassiicolin基因，划分为Cas0型，主要分布于马来西亚、斯里兰卡、印度和泰国等亚洲各植胶国家[8-9]。本研究利用cassiicolin毒素不同亚型的特异引物对中国橡胶树多主棒孢毒素的类型及其分布特征进行分析，并对不同亚型毒素的致病性进行了初步分析，这对深入了解多主棒孢的生物学功能和遗传进化关系具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

49个供试菌株寄主来源包括橡胶树（Hevea brasiliensis）、番木瓜（Carica papaya）、木薯（Manihot utilissima）、黄瓜（Cucumis sativus）和豇豆（Vigna unguiculata）等作物，其中橡胶树38株，番木瓜5株，木薯3株，黄瓜2株，豇豆1株；地理来源包括海南、广东、广西、云南（表1）。除2个分离自黄瓜的菌株由中国农科院蔬菜花卉研究所提供，其余菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所橡胶树病害课题组分离保存。为了确保遗传一致性，对各菌株进行了单孢纯化。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增和测序 菌体收集和DNA提取参照刘先宝等[10]的研究方法。本研究PCR扩增所用的引物参见表2，反应条件参照White等[11]和Déon等的方法[8]。PCR产物用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测，所得产物经Omega公司回收试剂盒回收后，克隆到pGM18-T载体，转化大肠杆菌，将阳性克隆送交华大基因技术有限公司进行序列测定。将序列在GeneBank中进行BLAST分析，并用MEGA6.0软件对其进行序列比对，分析序列的变异情况；利用MJ（Maximum Likelihood）统计方法中的Tamura-Nei model构建系统发育树。

1.2.2 致病性分析 选择具有不同类型毒素基因的多主棒孢菌株进行致病性测定。测定方法采用李博勋等[12]的毒素生物萎蔫法，计算各种质粗毒素经处理后的萎蔫指数，分析不同类型毒素的致病性差异。致病性分析所获数据均采用SAS9.0软件进行统计分析，按照李博勋等[12]的标准进行分级。

2 结果与分析

2.1 ITS序列分析

利用引物ITS1/ITS4从所有供试分离物的基因组DNA中均可扩增到一条大小为559 bp的单一条带，将片段回收测序后，在NCBI数据库中进行blast比对，确定所有分离物均为多主棒孢。序列之间比对发现，除在ITS1区的第135位点存在单核苷酸多态性，其他序列完全一致（表1）。

2.2 毒素基因检测与序列分析

分子检测结果见表1。49个供试菌株中78%的菌株被检测到含有cassiicolin基因，其中Cas2亚型有10个菌株，Cas5亚型有28个菌株，其它菌株中未检测到cassiicolin毒素基因，暂定为Cas0型。Cas5亚型菌株均来源于橡胶树，并且为橡胶树上的优势群体；Cas2亚型菌株则只有5株来源于橡胶树，其余来源于黄瓜、番木瓜和木薯等不同作物。在不同亚型橡胶树多主棒孢菌株的地理分布方面，Cas2亚型菌株在海南、广东和云南均有分布，但几率非常小；而Cas5亚型菌株在所有植胶区均有分布，不同毒素亚型菌株的分布与地理来源没有明显相关性。

经序列比对发现，本研究中测定的Cas2（KU561095）和Cas5（KU561094）毒素基因序列与GeneBank中已公布的相应序列相似性非常高，均超过99%（图1）。在所有供试菌株中均未检测到含有Cas1、Cas3、Cas4 和Cas6基因的菌株。通过多主棒孢cassiicolin基因系统发育分析发现Cas1、Cas2和Cas6亲缘关系更近，聚在一个大分支上，而Cas3、Cas4和Cas5则聚在另一个大分支上。

2.3 致病性分析

致病性结果发现Cas2、Cas5和Cas0 3种粗毒素对几种橡胶品种致病性存在显著差异。Cas2型粗毒素对IAN873的致病性最强，Cas5型粗毒素对GT1的致病性最强，Cas0致病性整体较弱，见图2。

3 讨论与结论

真菌ITS序列分析已经被应用于很多属的系统发育研究。在种内，ITS序列对于揭示异域分布或间断分布种群的关系具有一定的潜力。Nghia等[13]和Nguyen等[14]研究发现在橡胶树多主棒孢ITS的第135位点处存在单核苷酸多态性（C/T），根据这个差异将多主棒孢分离物划分为2个小种。在ITS1的第135位点具有C碱基的分离物被划分为Race1，而具有T碱基的分离物属于Race2。Race1分离物主要侵染RRIM600和其它一些早期品系，Race2分离物则主要侵染RRIM 2020和一些更新的品系。本研究通过对中国多主棒孢ITS序列进行分析发现，在ITS1区的第135位点处也存在单核苷酸多态性（C/T），而该位点的单核苷酸多态性与菌株的毒素类型存在一定相关性，其中Cas2亚型菌株在该处均为T碱基，而Cas5亚型菌株此处均为C碱基，这些可能与多主棒孢的小种分化有关。要明确本研究中供试分离物的小种划分，还需要使用以上提到的品系进行致病性分析。

cassiicolin基因对C. cassiicola整体的遗传结构具有重要的贡献，这些基因可能在该菌的生物学功能和遗传进化中发挥重要作用。本研究发现，中国橡胶树多主棒孢菌株具有Cas2和Cas5 2种亚型，其中Cas5亚型为橡胶树上多主棒孢的优势群体，还有一些菌株为Cas0型，而番木瓜、木薯、黄瓜等其它作物上的多主棒孢菌株主要为Cas2亚型和Cas0型。值得注意的是，在国外尚未发现有橡胶树多主棒孢Cas2亚型菌株。Déon等[8]研究发现，Cas2亚型是仅存在非橡胶树作物上的多主棒孢菌株，Cas5亚型是仅存在于亚洲国家的橡胶树多主棒孢菌株。Shuib等[9]对马来西亚橡胶树多主棒孢的Cassiicolin基因进行深入研究发现，其主要为Cas5亚型和Cas0型。笔者在多次的橡胶树棒孢霉落叶病病害调查中发现，若橡胶苗圃地周围由多主棒孢引起的番木瓜叶斑病发病严重，则该苗圃棒孢霉落叶病发病也非常严重。由此推测，中国的Cas2亚型橡胶树多主棒孢可能来源于其它作物，但还需做进一步的系统发育分析验证试验。

通过致病性研究发现，不同类型的毒素对不同橡胶品系的致病性存在明显差异，尤其是GT1和IAN873 2个品系。Cas2亚型毒素对IAN873的致病性强，对GT1致病性弱；而Cas5亚型毒素对这2个品系的致病性情况恰好相反。Breton等[2]利用来源于菲律宾、喀麦隆、印度和斯里兰卡等国家的供试菌株进行致病性分析发现，所有供试菌株对GT1品系的致病性较弱，而对IAN873品系的致病性则较强，根据文献报道，这些国家橡胶树多主棒孢主要为Cas1亚型或Cas0型[8]，这与本研究Cas2亚型毒素的致病性相似。由于菌株毒素类型的不同，造成致病性和寄主范围有所差异。为了明确中国橡胶树多主棒孢不同类型毒素的寄主专化性和小种的划分，还需要选择更多的橡胶品系和寄主植物做进一步的致病性研究。

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