海南省3种油茶炭疽病菌的致病力及其生物学特性研究

李杨 李河 周国英 蒋越西 刘君昂

摘 要 为了弄清海南省不同油茶炭疽病菌致病力差异及生物学特性，采用刺伤接种法对3种油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae）的致病力进行测定，发现不同病原间致病力存在显著差异，其中C. fructicola致病力最强，C. siamense致病力次之，C. camelliae致病力最弱。对3种炭疽病菌生物学特性研究发现，3种病菌最适生长温度、pH值及光照条件类似，同时均可利用多种碳、氮源，但不同病菌生长的最优碳源、氮源有一定差异。C. fructicola的产孢量、分生孢子萌发率及附着胞形成率均高于C. siamense及C. camelliae。不同油茶炭疽病菌生物学特性的差异可能与其致病力分化有关。本研究结果将为进一步研究不同油茶炭疽病菌致病差异机制提供理论依据。

关键词 油茶；炭疽病菌；致病力；生物学特性；分生孢子萌发；附着胞形成

中图分类号 S794.4 文献标识码 A

Abstract To clarify the virulence and biological characteristics of pathogens causing Camellia oleifera anthracnose in Hainan Province， wound inoculation was used to investigate the virulence of the three pathogens （Colletotrichum fructicola， C. siamense and C. camelliae） on C. oleifera. Significant difference was found in the virulence among the three pathogens. C. fructicola showed the strongest virulence to C. oleifera followed by C. siamense and C. camelliae in sequence. Biological characteristics of the three pathogens were investigated. It was similar on optimum temperatures， pH values and lights for the growth of the pathogens. These pathogens could utilize different kinds of carbon and nitrogen sources， but the optimum carbon and nitrogen sources for the growth of the pathogens were different from each other. C. fructicola had higher performance in sporulation， conidial germination and appressorial formation， compared with C. siamense and C. camelliae. The difference in the biological characteristics of the pathogens may be associated with their differentiated virulence. The results would provide a theoretical basis for further study of the pathogenic mechanism of the pathogens causing C. oleifera anthracnose.

Key words Camellia oleifera；Anthracnose pathogen；Virulence；Biological characteristic；Conidial germination； Appressorial formation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.018

炭疽病是油茶最重要的病害之一，由炭疽属（Colletotrichum Corda）真菌引起，导致油茶落叶、落果，造成严重的经济损失。许多研究认为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是引起油茶炭疽病的病原菌[1-5]。目前研究表明，胶孢炭疽菌是由炭疽属真菌中的许多种组成的复合种，Weir等[6]利用多基因谱系方法将胶孢炭疽菌复合种划分成22个种和1个亚种。近几年研究发现，引起油茶炭疽病的病原不止一种，李河等[7-8]利用ITS-CAL-GAPDH 3基因序列联合分析，发现果生刺盘孢菌（C. fructicola）和暹逻刺盘孢菌（C. siamense）也是油茶炭疽病的致病菌。为了有效防治油茶炭疽病，国内学者在油茶炭疽病原的鉴定[9]、生物防治[10]、品种抗性[11]等方面取得了一定的研究进展，但是不同油茶炭疽病菌在致病力分化、生物学特性等方面的比较研究未见报道。研究不同病菌致病力分化及生物学特性可为有效地、针对性地防治油茶炭疽病和抗病育种提供理论依据。

油茶是海南岛传统油料树种，在海南省内分布广泛，且栽培面积不断增加。海南省高温高湿的气候条件使得油茶炭疽病在岛内普遍发生，危害日益严重。笔者从海南省4个油茶林中分离鉴定了3种油茶炭疽病菌，并对其致病力及生物学特性进行比较研究，目的是阐明不同油茶炭疽病菌致病力差异，同时初步研究病原菌致病力与其生物学特性之间是否相关，旨在为进一步揭示油茶炭疽病菌致病力分化机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

油茶炭疽病叶样品采自海南省南圣镇、通什镇、枫木林场及澄迈林场4个样地，病原菌通过组织分离法，并经柯赫氏法则验证以及综合病菌形态、多基因序列分析鉴定为炭疽病菌[12]，菌株分离地、数量等信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 致病力测定 每个采样地每种油茶炭疽病菌随机选取1株菌株，采用离体叶片接种进行致病力测定。方法如下：无菌水配制3种油茶炭疽病菌分生孢子悬浮液（1×105个/mL）。选取健康、大小一致的2年生“湘林1号”油茶叶片作为接种对象，用75%酒精将叶片消毒30 s，再用无菌水将叶片清洗3次后晾干，使用一次性注射器针头将叶片背面表皮挑破但不刺穿，移液器滴加20 μL孢子悬浮液于伤口处，以滴加等量无菌水作为对照。每菌株接种10张叶片，实验重复3次，叶片放置铺有湿润脱脂棉的培养皿中，置于28 ℃恒温箱中培养。叶片产生症状后，对油茶叶片进行病情分级。

病害分级标准如下：0级为不发病；1级（0<病斑直径≤2 mm）； 2级（2 mm<病斑直径≤5 mm）； 3级（5 mm<病斑直径≤10 mm）； 4级（10 mm<病斑直径≤15 mm）； 5级（病斑直径>15 mm）。

1.2.2 温度、pH值及光照对菌株菌丝生长影响

将培养7 d的3种炭疽病菌菌块（d=5 mm）分别接至新的PDA培养基中，设计以下条件进行培养：（1）放至10、15、20、25、28、30、35及40 ℃恒温培养箱中黑暗培养，每处理3个重复； （2）配制pH值分别为4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基，将3种炭疽病菌菌块分别接至上述平板中，每处理3个重复； （3）将接种后的平板放置于完全光照、12 h光照/12 h黑暗、完全黑暗下进行培养，每处理3个重复。5 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3 不同碳源、氮源对菌株菌丝生长影响 以察式培养基为基础[13]，分别以葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖作为培养基中的碳源，以牛肉膏、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、酵母浸粉作为培养基中的氮源，将3种炭疽病菌菌块（d=5 mm）分别接至含有不同碳源、不同氮源的平板中，以不添加碳、氮源培养基为对照，28 ℃恒温培养，每处理3个重复，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4 不同油茶炭疽病菌产孢能力、孢子萌发率及附着胞形成率比较 产孢能力：将培养7 d的3种炭疽病原菌块（d=5 mm）分别接至100 mLPDA液体培养基中，160 r/min，28 ℃恒温震荡培养，第5天用孢子过滤器收集孢子，并配制成悬浮液，利用血球计数板计算分生孢子数；孢子萌发率及附着胞形成率：将浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液加入凹玻片中，将凹玻片移入放有湿润脱脂棉的培养皿中，培养皿置于28 ℃培养箱中培养，每处理为5张玻片，每片检查80个孢子，重复3次，12、24 h观察并记录分生孢子萌发率（以芽管长度超过孢子长度1/2为萌发），观察并统计孢子萌发率及附着胞形成率。

1.3 数据分析

利用SPSS、Excel软件对数据进行统计与分析，用最小显著差数法（LSD）比较相同条件下3种油茶炭疽病菌的差异显著性（p=0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同油茶炭疽病菌致病力比较

从海南省分离到的油茶炭疽病菌对油茶叶片的致病性测定结果发现，所有供试菌株均能引起油茶叶片发病（图1），对照组中叶片刺伤处有很小的黑点，但并未扩展。由表2可知，从4个油茶林中分离到的3种炭疽病菌的致病力存在较大差异，但属于同种病菌的不同菌株间致病力差异不大，其中C. fructicola致病力最强，病情指数为76.33～78.33，明显高于其他油茶炭疽病菌；而C. siamense致病力较强，病情指数为61.67～65.83。从澄迈林场分离的C. camelliae致病力低于C. fructicola及C. siamense，病情指数仅为57.5。从总体来看，3种病菌的致病力依次为C. fructicola>C. siamense>C. camelliae，与3种病菌的分离率相一致。

2.2 病原菌生物学特性

2.2.1 温度、pH值及光照对不同炭疽菌生长的影响 由图2可知，3种油茶炭疽病菌在10～35 ℃范围内生长，且生长趋势类似，最适生长温度均为28 ℃；在同一温度下，C. siamense、C. fructicola与C. camelliae菌落生长均存在显著差异；28 ℃时，C. siamense生长最快，其次是C. fructicola，C. camelliae生长较慢。由图3可知，3种病菌在pH4.0～11.0范围内均可生长，当pH6.0时，3种病菌均生长最快，且菌落直径有一定差异，C. fructicola为62.3 mm、C. siamense为64.7 mm、C. camelliae为57.4 mm。除pH5和pH6，C. fructicola与C. siamense菌落大小差异不显著，但两者与C. camelliae存在显著差异。由表3可知，在相同光照处理下，C. fructicola、C. siamense与C. camelliae的菌落大小存在显著差异；在12 h光照/12 h黑暗处理下，C. fructicola与C. siamense菌落直径均达到最大值，但C. camelliae在连续光照条件下生长最快，这可能与菌株本身特点有关。

2.2.2 不同碳源、氮源对炭疽病菌生长的影响 由图4可知，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae均可在不同碳源上生长，除了以果糖为碳源外，3种病菌在相同碳源上生长均存在显著差异，其中C. fructicola和C. siamense在碳源为葡萄糖、麦芽糖的培养基中生长最好；C. camelliae在乳糖、葡萄糖中生长最好，且3种病菌在淀粉培养基中生长差。当碳源为葡萄糖时，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae的菌落直径分别为62.1、62.5和55.7 mm；当碳源为麦芽糖时，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae的菌落直径分别为60.5、61.0和55.0 mm。

由图5可知，3种病菌对不同氮源的利用存在较大差异。C. fructicola在牛肉膏及酵母浸粉培养基上菌落直径最大，C. siamense在硝酸钾培养基中菌落直径最大，C. camelliae在蛋白质培养基上生长最好；3种病菌在氮源为氯化铵、硫酸铵的培养基上生长无显著差异，均生长最差，菌落直径为20 mm左右，可见氯化铵、硫酸铵对炭疽病菌菌丝的生长有抑制作用。

2.2.3 不同油茶炭疽病原产孢能力、孢子萌发率及附着胞形成率比较 3种油茶炭疽病原菌的产孢能力有差异，在培养5 d后，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae产孢量分别达到35.1×106、29.6×106和25.5×106个/mL。培养4 h后，C. fructicola和C. siamense的分生孢子开始萌发，6 h后C. camelliae的分生孢子开始萌发（图6）。培养12和24 h后，3种病菌在分生孢子萌发率及附着胞形成率上均存在显著差异，C. fructicola的分生孢子萌发率及附着胞形成率高于其他病菌（图7），而C. camelliae分生孢子萌发率及附着胞形成率最低。

3 讨论与结论

一种炭疽病菌可侵染多种寄主植物，同时多种炭疽病菌也可以侵染同一寄主植物。例如引起辣椒炭疽病的有C. acutatum、C. truncatum、C. fructicola和C. siamense等4种致病菌[14-16]。本实验室研究成员前期从海南省4个油茶林中分离鉴定了34株油茶炭疽病菌，共有3种不同炭疽病菌：C. fructicola、C. siamense及C. camelliae。本研究采用刺伤接种法对3种油茶炭疽病菌的致病力进行测定，发现3种病菌存在明显的致病力分化，并且致病力最强的C. fructicola在所有菌株中所占比例最大。王晓艳[17]从东北三省大豆主产区分离到8种镰刀菌，通过致病力测定，发现在黑龙江、吉林和辽宁省F. oxysporum的致病力都是最强，病情指数明显高于其他Fusarium spp.，同时F. oxysporum在分离到的8种镰刀菌中出现频率最高。本研究推测菌株致病力越强可能对环境的适应能力越强，因此在自然界中容易扩展其分布范围，这有待于进一步研究。

3种油茶炭疽病菌生物学特性观察结果表明，在相同温度、pH、光照条件、碳源和氮源的条件下，3种油茶炭疽病菌的菌丝生长存在一定差异。3种油茶炭疽病菌均可在10～35 ℃范围内生长，且最适生长温度均为28 ℃，这与朱英芝[9]的研究结果一致；3种病菌均可在pH4.0～11.0范围内生长，且在pH6.0时菌丝生长最快，这与史红安[18]报道的结果类似。强致病力C. fructicola的产孢能力、孢子萌发率及附着胞形成率均高于C. siamense和C. camelliae，推测不同油茶炭疽病菌的致病力可能与其产孢量、孢子萌发率及附着胞形成率存在一定关系。张新春等[19]对11株不同来源的荔枝胶孢炭疽菌进行了致病性测定，发现不同菌株的致病性存在差异，并发现强致病力菌株和弱致病力菌株在分生孢子及分生孢子盘形态方面存在一定差异，而在菌丝生长、形态等方面类似；朱荷琴等[20]对棉花黄萎病不同致病菌株的生物学特性进行了比较，发现强致病菌株的生长量、产孢量及产毒量都高于弱致病菌株。

附着胞是病原菌在其芽管或老菌丝顶端发生膨大，分泌黏状物，借以牢固地粘在宿主表面的一种侵染结构，在其下形成纤细的针状感染菌丝，以侵入宿主的角质表皮而吸取养料[21]。因此，病菌附着胞形成的多少及快慢可能与其致病力有一定关系，致病力较强的菌株更易侵染油茶，使其在自然界生态位竞争与繁殖中占有优势。但致病力差异不仅仅是菌株产孢量、分生孢子萌发率及附着胞形成率的差别，还与菌株其他遗传特性有很大关系，笔者仅就3种油茶炭疽病菌的部分生物学特性进行了探讨，接下来可对不同油茶炭疽病菌的致病差异机制进行研究，为针对性地防治油菜炭疽病提供理论依据。

参考文献

[1] 周仲铭. 林木病理学[M]. 北京： 中国林业出版社， 1990： 117-119.

[2] 袁嗣令， 邵力平， 李传道. 中国乔、 灌木病害[M]. 北京： 科学出版社， 1997： 42.

[3] 杨光道， 束庆龙， 段 琳，等. 主要油茶品种对炭疽病的抗性研究[J]. 安徽农业大学学报， 2004， 31（4）： 480-483.

[4] 刘 伟. 油茶炭疽病的病原学、发生规律及防治技术研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2012.

[5] 崔之益， 李蕊萍， 胡加新， 等. 油茶炭疽病研究进展[J]. 现代农业科技， 2014（12）： 141-142.

[6] Weir B S， Johnston P R， Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 115-180.

[7] 李 河， 周国英， 徐建平，等. 一种油茶新炭疽病原的多基因系统发育分析鉴定[J]. 植物保护学报， 2014， 41（5）： 602-607.

[8] 李 河， 周国英，徐建平. 一种新油茶炭疽病原多基因序列鉴定[J]. 植物保护， 2015， 41（2）： 92-96.

[9] 朱英芝， 廖旺姣， 邹东霞，等. 广西油茶炭疽病病原菌鉴定及生物学特性[J]. 植物保护学报， 2015， 42（3）： 382-389.

[10] 游 嘉， 周国英， 刘君昂，等. 油茶内生拮抗细菌Y13菌剂研制[J]. 中南林业科技大学学报， 2010， 30（4）： 131-134.

[11] 杨 华， 赵丹阳， 秦长生，等. 不同油茶种和品种对炭疽病的抗性观察[J]. 植物保护， 2015， 41（2）： 195-199.

[12] 李 河， 李 杨， 蒋仕强，等. 海南省不同寄主植物炭疽病菌侵染油茶研究[J]. 植物保护， 2016， 42（4）： 64-70.

[13] 方中达. 植物病理研究方法（第3版）[M]. 北京：中国农业出版社， 1998： 50.

[14] Diao Y， Zhang C， Xu J， et al. Genetic differentiation and recombination among geographic populations of the fungalpathogen Colletotrichum truncatum from chili peppers in China[J]. Evolutionary Applications， 2015， 8（1）： 108-118.

[15] Sharma G， Shenoy B D. Colletotrichum fructicola and C. siamense are involved in chilli anthracnose in India[J]. Archives of Phytopathology and Plant Protection， 2014， 47（10）： 1 179-1 194.

[16] Vitale S， Infantino A. Presence of Colletotrichum acutatum causing anthracnose on hot pepper in central Italy[J]. Journal of Plant Pathology， 2014， 96（3）： 607.

[17] 王晓艳，文景芝. 东北三省大豆根腐镰孢菌种类及其致病力分析[J]. 中国油料作物学报， 2011， 33（4）： 391-395.

[18] 史红安， 傅本重， 张志林，等. 侵染油茶的两种病原菌的鉴定及其生物学特性研究[J]. 湖北农业科学， 2015， 54（23）： 5 908-5 911.

[19] 张新春， 彭元科，王家保. 不同来源荔枝胶孢炭疽菌生物学特性研究[J]. 中国果树， 2015（3）： 27-31.

[20] 朱荷琴， 宋晓轩，简桂良. 棉花黄萎病菌致病力变异生理机制的初步研究[J]. 棉花学报， 2004， 16（5）： 275-279.

[21] 张敬泽， 胡东维. 影响柿树炭疽菌孢子萌发、附着胞形成及致病性的环境因子[J]. 植物病理学报， 2004， 34（2）： 154-161.