不同地理来源的甘蔗梢腐病菌营养体亲和性研究

郭强 崔一平 徐世强 张木清

摘 要 为探讨甘蔗梢腐病病原菌菌株的群体结构及种内的分化，以采自广西、云南、福建和海南等不同地区的30个甘蔗梢腐病菌株为材料，通过初步的分子生物学鉴定，发现30个甘蔗梢腐病菌株分属于2个不同的病原种。利用KClO3培养基诱导筛选获得Nit突变体，其中1个菌株没有产生Nit突变体，剩下的29个菌株共产生266个Nit突变体。营养体亲和群的测定结果表明：9个菌株的VCG没有同一性，1个菌株组成1个VCG；不同地理来源的甘蔗梢腐病菌株间互不亲和，分属于不同的VCG；同一地理来源的甘蔗梢腐病菌株间亦不亲和；暗示引起甘蔗梢腐病的串珠镰刀菌属群体内存在丰富的VCG多样性，在不同的栽种地区群体结构变化很大，并且营养体亲和性与菌株的地理来源及寄主品种都没有明显的相关性。

关键词 甘蔗梢腐病；串珠镰刀菌；Nit突变体；营养体亲和群

中图分类号 S432.44 文献标识码 A

Abstract Sugarcane pokkah boeng disease has become an important disease in china. In order to analysis the population structure and the genetic differentiation in species of the pathogen. The 30 strains of Fusarium moniliforme were collected individually from the pokkah boeng samples in Guangxi， Yunan， Fujian and Hainan provinces in China. Based on the molecular biology analysis， 30 isolateds divide into two species. After single spore isolation， 266 nitrate-nonutilizing（Nit）mutants were got from 29 strains after these colony transplanted on potato sucrose agar medium with 1.5% KClO3（KPS）； 1 strains can't produce nit mutant. Furthermore， vegetative compatibility of these strains were analyzed on MM plates. In this study， the results show that all of the 9 isolates don't have VCG with each other，or 1 strains correspond to 1 VCG. This phenomenon occur not only in the strains from different geographic origins but also in the strains from the different host varieties in the same geographic origins. All these results indicate there was abundant diversity of VCG in the population of F. moniliforme， and there was no obvious correlation between the vegetative compatibility and geographic origins or host varieties.

Key words Sugarcane Pokkah Boeng Disease； Fusarium moniliforme； Nit mutant； Vegetative compatibility groups

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.017

真菌营养体亲和性（Vegetative compatibility）又称体细胞亲和性（Somatic compatibility），是指真菌菌株间菌丝能融合并交换细胞质或核物质的特性；根据营养体亲和性划分的群体称为营养体亲和群（Vegetative compatibility group， VCG）[1-2]。自1923年Cayley等[3]首次报道发现了植物病原真菌营养体亲和与不亲和现象。目前，VCG已经逐渐成为研究病原真菌遗传变异、种群地理分布、生理小种鉴定等重要手段[4-5]。在中国，VCG方法已经广泛应用在栗疫病、黄瓜枯萎病、向日葵黄萎病和水稻纹枯病等病原菌的分类上[6-9]。而涉及串珠镰刀菌属真菌的研究则较少，有关甘蔗梢腐病病原菌的营养体亲和性研究尚未见报道。

甘蔗梢腐病是甘蔗上一种重要的真菌病害，对甘蔗生产造成了巨大的经济损失[10]。近年来，甘蔗梢腐病在中国广西、云南、福建以及海南等蔗区呈现出逐渐加重的趋势。过去的研究发现，甘蔗梢腐病主要发生在高温多湿的夏季，病原菌主要属于F.verticillioides[12]。本实验室在冬季进行田间调查时发现，冬季的甘蔗上也出现了梢腐病的危害；通过分离鉴定发现引起冬季梢腐病的病原菌属于F. proliferatum[12]。同时发现同一病原小种在不同的甘蔗品种上的危害性也不同。出现这种现象的原因，除了品种抗感性不同外，还有可能是病原种内也存在着分化现象。为了进一步解析这种现象，同时对新发现的甘蔗梢腐病病原种F. proliferatum与F.verticillioides是否具有营养体亲和性进行进一步的研究。本文期望通过甘蔗梢腐病菌株营养体亲和性的研究，旨在明确同一地理位置不同甘蔗品种以及不同地理来源的甘蔗梢腐病菌的营养体亲和群和病原菌群体内的VCG结构，探索甘蔗梢腐病菌的种内分化、病害流行规律，更好地了解其种群组成，为甘蔗梢腐病菌遗传变异的机制研究提供参考，并为其综合治理和抗病育种研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 30个供试菌株（Fusarium moniliforme）于2013～2015年期间分别采集于广西、云南、福建、海南等地，经单孢分离鉴定后获得（表1）。

1.1.2 培养基 培养基及其组成成分见表2。

1.2 方法

1.2.1 Nit突变体诱导 将供试菌株接种于PDA平板上，于28 ℃培养箱中活化4 d。挑取活化好的菌落边缘直径约5 mm的菌块，转接于KPS（1.5%KClO3）培养基中，每个培养皿接一块，每个菌株5个重复，于28 ℃恒温暗培养箱中培养，观察菌落生长情况。若形成不规则菌落（非放射状菌落或扇形角变区），则为抗氯酸盐突变体。

在不规则菌落的不同突变区挑取菌落边缘的幼嫩菌丝转接于MM培养基中，野生型菌株作为阴性对照。于28 ℃培养箱中培养4 d，观察菌落生长情况。若产生气生菌丝，则说明其为抗氯酸盐突变体，而未形成硝酸盐利用缺陷型突变体，应将其丢弃。若不产生气生菌丝或菌落很稀薄，说明形成了硝酸盐利用缺陷型突变体，即Nit突变体，应将其转入MM斜面，4 ℃保存备用。

1.2.2 Nit突变体稳定性鉴定 将获得的Nit突变体转接于PDA培养基中，于28 ℃培养箱中培养4 d后，挑取菌落边缘的幼嫩菌丝转接于MM培养基中，28 ℃培养箱中培养4 d，并观察其生长情况。若产生气生菌丝，则说明Nit突变体不稳定，应将其丢弃。若仍不产生气生菌丝或菌落很稀薄，则说明形成了稳定的Nit突变体，应将其转入MM斜面，4 ℃保存备用。

1.2.3 Nit突变体生理表现型鉴别 将稳定的Nit突变体分别转接于MM（硝酸钠为唯一氮源）、NM（亚硝酸钠为唯一氮源）和HM（次黄嘌呤为唯一氮源）3种培养基中，于28 ℃培养箱中培养4 d。根据菌落生长情况将Nit突变体划分为4种生理表型；在MM培养基中不产生气生菌丝或菌落很稀薄，而在NM和HM培养基中均能正常生长的的突变菌株为Nit1；在MM和HM培养基中不能生长或菌落很稀薄，而在NM培养基中能正常生长的突变菌株为NitM；在MM和NM培养基中不能生长或菌落很稀薄，而在HM培养基中能正常生长的突变菌株为Nit3；在MM、NM和HM三种培养基中均不能生长或菌落很稀薄的突变菌株为Nit4（图1）。

1.2.4 Nit突变体异核体自身亲和性测定 挑取NitM突变体菌落边缘的幼嫩菌丝直径约5 mm的菌块，放置于MM培养基中间，周围等近距离放置同一菌株的Nit1和Nit3突变体，进行互补配对实验，两菌株间距2 cm，每平板放置4～6个菌株，于28 ℃恒温暗培养箱中培养4～7 d。若在NitM与Nit1或Nit3突变菌株菌落交界处出现野生型生长，形成一条浓密的气生菌丝带，则说明该菌株具有异核体自身亲和性（HSC）。反之，若菌株间没有形成明显的气生菌丝带，只有稀薄的菌丝，则为异核体自身不亲和性（HSI）。

1.2.5 营养体亲和群（VCG）的测定 根据异核体自身亲和性鉴定结果，各菌株分别选取2～3株具有强亲和力的NitM突变体，挑取其菌落边缘的幼嫩菌丝直径约5 mm的菌块，放置于MM培养基中间，周围等近距离放置不同菌株的Nit1和Nit3突变体，进行互补配对培养，两株菌间距2 cm，每平板接4～6个菌株，于28 ℃恒温暗培养箱中培养4～7 d。若在NitM与Nit1或Nit3突变菌株菌落交界处出现野生型生长，形成一条浓密的气生菌丝带，则说明这两个菌株属于同一营养体亲和群（VCG）；若菌丝交界处没有形成气生菌丝带，则两菌株不属于同一个营养体亲和群（VCG）。

2 结果与分析

2.1 甘蔗梢腐病菌Nit突变体的筛选与鉴定

甘蔗梢腐病菌在PDA培养基上活化4 d后，移入KPS培养基中诱导培养；菌株在KPS培养基中1～2 d内基本不生长，受到了严重的抑制；第4天开始出现菌丝的缓慢生长，第5天在菌落的一侧出现旺盛的气生菌丝生长，形成扇形角变区（图2-A），即抗氯酸盐突变体。这些抗氯酸盐突变体转移到MM培养基中培养，其菌落形态和颜色较野生型菌株在PDA培养基上有较大差异；在MM培养基上，菌丝呈无色、匍匐状生长，无气生菌丝生成，生长速度与野生型菌株在PDA上的生长速度大致相近，说明该菌株不能利用硝酸盐，即为Nit突变体。一些抗氯酸盐突变体在MM培养基上仍以野生型生长，说明该菌株即抗氯酸盐，又能利用硝酸盐，不属于Nit突变体。

将获得的Nit突变体转移到PDA培养基中培养4 d后，再回接于MM培养基。Nit突变体中绝大部分仍不产生气生菌丝或菌落很稀薄，即保持了Nit突变体的生长特征，但也有少数Nit突变体在MM培养基中恢复了野生型生长，即为不稳定的Nit突变体。由此可见，绝大部分Nit突变体是稳定的，只有小部分Nit突变体不稳定。

30个供试的甘蔗梢腐病菌株只有YN32未获得Nit突变体，其余的菌株均获得了Nit突变体。依据Nit突变体在MM、NM和HM 3种培养基上的生长特征，可将Nit突变体分为Nit1、NitM、Nit3和Nit4共4种类型的突变体（图1）。其中大部分为Nit1突变体，占到了总突变体数的80%以上，其余3种类型的突变体较少；Nit1、NitM、Nit3和Nit4分别占突变体总数的86.09%、7.89%、5.26%和0.75%（表3）。

2.2 Nit突变体异核体自身亲和性测定

30个供试菌株中只有9个菌株获得了NitM突变体（表3），对这9个菌株进行异核体自身亲和性鉴定，即菌株自身的NitM与Nit1或Nit3配对培养。结果显示，9个菌株均能发生营养体自身亲和，即两稀疏生长的菌落交界处形成旺盛的气生菌丝带，这表明9个菌株都具有异核体自身亲和性（图2-B）；而其余菌株未获得NitM突变体，未能进行自身亲和性测定。

2.3 甘蔗梢腐病菌营养体亲和群的划分

由于只有GX4、GX18、GX17、GX31、GX6-2、YN41、YN49、FJ9和FJ64等9个菌株获得了NitM突变体，所以只能利用这9个菌株进行菌株间的互补配对实验。实验结果表明（表4），来源于广西的GX4、GX18、GX17、GX31、GX6-2，云南的YN41和YN49，福建的FJ9和FJ64分别与不同地区的其他菌株进行互补配对实验，均未发生营养体亲和性，说明它们分属于不同的VCG；同一地区内不同区域来源的菌株间进行互补配对实验，亦未发生营养体亲和性，其中广西区内的柳州、河池和百色区域的菌株均获得了NitM突变体，可进行不同区域内的菌株间的互补配对实验，但均未发生营养体亲和性，说明不同区域内的菌株来自于不同的VCG；有趣的是，同一区域内的不同菌株间，同样没有发生营养体亲和性。由此可见，甘蔗梢腐病菌基本上为1个菌株组成1个VCG，也就是说甘蔗梢腐病菌的VCG基本上没有同一性。

3 讨论

串珠镰刀菌引起的甘蔗梢腐病对甘蔗生产造成了重大的损失，本文利用营养体亲和性方法解释了串珠镰刀菌内一定程度的群体结构。过去的研究表明，营养体亲和性与菌株生长的环境有一定的关系，特别是培养基的pH[6]。本文中培养30个菌株所使用培养基的pH一致，所以可以排除环境因素，仅就菌株本身的营养亲和性进行说明。本研究利用KClO3对甘蔗梢腐病菌株进行诱导突变，获得Nit突变体，并通过在不同营养缺陷培养基上的筛选确定突变体的类型（Nit1、NitM、Nit3和Nit4），进而对甘蔗梢腐病菌株进行营养亲和性研究。其中，NitM突变体具有较强的亲和能力，而Nit1和Nit3的亲和能力较弱[13]；研究发现，菌株与自身的NitM都具有非常强的亲和能力，而少数几个菌株的Nit1和Nit3也具有一定的亲和能力。

较早的研究报道[14-15]认为，菌株间的亲缘关系取决于地理分布，来源于相同或相邻地区的菌株具有更大的遗传相似性。但据潘月梅[16]、余霞等[17]的研究表明，VCG与地理分布间并不存在明显的关系，同一地域可能存在多个 VCG或同一VCG分布于多个地理区域；同时Sidhu[18]、Klittich[19]、潘月梅等[16]的研究也表明，串珠镰刀菌的田间群体结构非常复杂。本研究中，分离自广西、云南、福建和海南等4个地区的30个梢腐病菌株群体间的VCGs互不相同，没有属于同一个VCG的菌株，同时存在于4个地区或其中2个或3个地区的群体中；而来自于同一地区的甘蔗梢腐病菌株亦未发现相同的VCG。说明引起甘蔗梢腐病的串珠镰刀菌群体内存在丰富的VCG多样性，田间群体结构变化很大；同时也证明VCG与菌株的地理来源并没有明显的直接关系

据Elena等[20]的研究结果表明，同一地理区域中同一寄主品种的菌株通常为同一VCG群。本研究中，除部分菌株未能确定寄主品种外，同一地理区域的供试菌株几乎采自不同的甘蔗品种，只有2对菌株采自相同的甘蔗品种，即YN5和YN32采自粤糖60，YN46和YN67采自ROC22；但由于本研究中YN46和YN67菌株没有获得NitM突变体，未能进行亲和性实验，所以不能确定它们是否属于同一个VCG。但是本研究中发现采自同一地区不同甘蔗品种上的甘蔗梢腐病菌株没有出现营养体亲和的现象，说明营养体亲和性与寄主品种也没有相关性。

本文共分析了30个甘蔗梢腐病菌株，初步表明该群体内存在丰富的VCG多样性，但由于样品的局限性，没有对不同地理区域的串珠镰刀菌菌群结构进行详细的分析和总结。在以后的研究中需要采集更多地理区域，更多甘蔗品种上的梢腐病菌株进行分析，以便更全面地分析甘蔗梢腐病菌的VCGs多样性状况以及VCG与菌株地理来源以及寄主品种之间的相互联系。同时由于在研究串珠镰刀菌营养体亲和方面没有成熟的技术可以借鉴，本研究也存在着一定的不足，虽然30个菌株几乎都能够获得nit突变体，但是在获得NitM突变体的筛选概率上偏低，仍需对该病原菌菌株的培养条件进行进一步的优化。

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