臭参活性成分乙酸乙酯部分的分离

栾云鹏　王启明

摘 要 此实验的目的：分离臭参中主要的活性成分。方法：先用95%乙醇初步提取在经过石油醚、乙酸乙酯萃取，把得到的乙酸乙酯萃取的部分用氯仿——甲醇梯度洗脱（100：0～70：30）。结果：乙酸乙酯萃取的部分洗脱出A、B、C、D共4个部分。

关键词 臭参 活性成分 乙酸乙酯 分离

中图分类号：R284.2 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.01.073

Separating the Active Ingredient Ethyl Smelly Reference Section

LUAN Yunpeng， WANG Qiming

Abstract The purpose of the experiment： the separation of smelly and the activity of the main ingredients. Methods： preliminary extraction with 95% ethanol by petroleum ether， ethyl acetate extraction， part of the ethyl acetate extract of gradient elution with chloroform， methanol （100：0 ～ 70：30）. Results： ethyl acetate extraction part of the elution of the A， B， C， D， A total of four parts.

Key words smelly and; Active ingredients; Ethyl acetate; separation

臭参为桔梗科（CAMPANULACEAE）党参属（Sect. Codonopsis）植物心叶党参 （Codonopsis cordifolioidea P. C. Tsoong）的根，别名土党参，棱子党参，古灯茶根，古东根等，臭参根含有黄酮香豆素、挥发油、糖、氨基酸、蛋白质、生物碱、有机酸、鞣质、酚类、树脂和少量皂苷等成分，其中黄酮香豆素为其主要成分之一。①臭参在云南有野生者，家种者，但市售多为家种，其移为家种已有近百年历史。臭参产量高，价廉，资源十分丰富，每年秋冬季集市上随处可见，售量相当可观。臭参在云南具有悠久的应用史和广泛的群众应用基础。臭参的根具有补中益气，润肺生津，补肺止咳的功效，在云南作为廉价的滋补品使用，每逢秋冬季节在蔬菜市场大量销售，与同属中药党参相比，臭参还具有排除体内积气的作用，类似“以通为补”。②③

野生植株全体近于光滑无毛或叶片疏生短刺毛。根未见。茎缠绕，长1米以上，直径约3～4毫米，有少数极短分枝。主茎上的叶稀疏，互生，两叶相距约10厘米左右，叶柄线状，长5～9厘米，叶片阔卵形，甚大，长宽可达10？厘米，顶端短渐尖或急尖，基部近于心形，湾缺方形，叶脉明显，侧脉自基部分出，近全缘，上面绿色，下面灰绿色;短细枝顶端通常仅2叶对生，叶柄较短，长不及1厘米，叶片与主茎上叶片相似，但湾缺不呈方形而远较细小。花单生于叶腋外，花梗与叶互生，长3～6厘米;花萼贴生于子房中部，筒部半球状，裂片三角状披针形，长1厘米，宽5～6毫米，顶端渐尖，全缘，湾缺尖狭;花冠钟状，长约1.7～1.8厘米，直径约1～1.2厘米，顶端近于1/2浅裂，裂片披针状三角形，深蓝色;花丝基部扩大，长约5毫米，花药亦长约5毫米。蒴果下半部半球状，上部有喙，直径约1.5厘米。种子多数，近于椭圆状，细小，棕色，有不明显网纹。花果期9～10月。④

1 仪器与材料

仪器：

分析太平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司）ISO 9001 京制00000249号  c=10d Max220  d=0.001g

索氏提取器一套（500ml圆底烧瓶，100ml索氏提取器，配套冷凝管）旋转蒸发仪  RV8 032014（IKR公司）

MA99-2A自动核酸蛋白分离层析仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）系统配置：HD-2核酸蛋白检测仪1台，BS-100A自动部分收集器1台，BT-100恒流泵1台，TH-500梯度混合仪1台，XWT-S台式记录仪1台，标配层析住1套（1.0*40普通层析住1支，1.6*50普通层析住1支，2.5*60中压层析住1支）50ml的分液漏斗

试剂：

柱层层析硅胶 型号：规格3，粒度：200～300目，批号：0140015（青岛海泽化工厂分厂）

乙醇（95%） 分析纯 批号：2013年5月02日  执行标准：GB/T 679-2002，许可证号：（滇）XK13-011-00001-38（天津市风船化学试剂科技有限公司）

乙酸乙酯 分析纯 批号：20140402  执行标准：GB/T 12589-2007，许可证号：（粤）XK13-011-00005（广东光华科技股份有限公司）

三氯甲烷 分析纯 批号：20121208  执行标准：GB/T 682-2002，许可证号：（滇）XK13-011-00001-34（云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司）

丙酮 分析纯 批号：20111203  执行标准：GB/T 686-2008，许可证号：（滇）XK13-011-00001-24（云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司）

甲醇 分析纯 批号：141225  执行标准：GB/T 683-2006，许可证号：（川）XK13-011-00015（四川西陇化工有限公司）

石油醚（60～90℃） 批号2013092601 执行标准：GB/T15894-2008，许可证号：XK13-201-00306 （四川西陇化工有限公司）。

植物材料：

臭参原材10公斤，市售品，于2015年1月购买，产地云南宜良，农户栽种品种。

2 提取与分离

2.1 臭参活性成分的提取

从市场上购买的臭参原材10公斤放入-70℃的超低温冰箱中保存，使用时从超低温冰箱中取出臭参原材在常温下解冻，清洗干净表面泥土，在干燥通风阴暗的环境下把洗净的臭参原材表面水分晾干待用。用菜刀把处理好的臭参原材切成片，用分析太平称取50g用纱布包好放入100ml的索氏提取器中，用量筒量取95%乙醇300ml放入500ml的圆底烧瓶中，安装好索氏提取器装置后进行验漏处理，确认装置完好、可以正常使用。接通冷凝水，打开水浴锅加热，温度设定为78℃，回流提取3次。取提取液经过旋转蒸发仪处理减压回收溶剂，得到浓缩后的提取物2g。

2.2 臭参活性成分的分离

浓缩后的提取物2g加入10ml蒸馏水悬浮，放入50ml的分液漏斗后加入10ml石油醚（60～90℃）进行萃取，萃取操作为：（1）进行验漏处理，可以通过对磨砂口涂抹少量凡士林来进行防漏。（2）关闭分液漏斗的阀门，一手紧握阀门防止摇晃时松开、一手用玻璃塞塞紧上出口，水平放置后充分摇晃使里面的两种互不相融的液体进行充分接触使萃取物能被萃取液充分的溶解，每摇晃一分钟左右后应该打开上出口放气，控制分液漏斗内的气压在安全范围内。萃取摇晃3次后把分液漏斗竖直静置，直到两种液体的分界线不再变化为止。（3）打开阀门从下出口放出在下层的液体，上层的液体从上出口放出。把萃取后得到的水部分在用乙酸乙酯10ml进行萃取，得到乙酸乙酯部分和水部分。用得到的乙酸乙酯部分进行梯度洗脱，经氯仿——甲醇（100：0～70：30）梯度洗脱 。

2.2.1 准备工作

（1）把系统电路和液路安装好。

（2）在断电情况下，把“滤光片”安装孔中的检测波长调整到280nm，换上280nm波长的“滤光片”盒，波长数字正面向上插入孔中。

（3）打开检测仪的电源，首先让检测仪预热30-60分钟。

2.2.2 样品（液体）流向及管路连接

缓冲液体或样品→层析住→“进口”（上）→层析住（下）→检测仪“进”口（下）→检测仪“出”口（上）→恒流泵→收集试管

2.2.3 系统调试

（1）检测仪调试。

①仪器预热30～60分钟后，可对检测仪进行调试。

②检查检测仪波长是否正确。

③把“灵敏度”选择为“T”档，“T”指示灯亮，调节“T”旋钮，使“T”为“100”（此时透过率“T”为100%，显示屏显示“100”）。

④把“灵敏度”选择为“1A”档，“A”指示灯亮，调节“调节”旋钮，使“A”为零（此时透过率“A”为零，显示屏显示“0”）。

⑤用分析太平称取40g柱层层析硅胶（200～300目）于100ml烧杯中，在用量筒量取40ml三氯甲烷加入该烧杯中，用玻璃棒充分搅拌直至溶液中无明显颗粒状物，把搅拌充分的溶液装入到1.6*50普通层析住中，装柱时要连续不断、一气呵成。装好后接通恒流泵电源，调节到1ml/s的流速，使“缓冲液”流过检测仪“样品池”进行洗柱，用木棒不断敲打层析住使里面的气泡从上方排除。此时调节“T”旋钮，使透过率“T”为“100”，调节“调零”旋钮，使吸光度“A”为“0”。此时系统达到平衡，样品流过检测仪时，电脑根据样品浓度绘制图谱成一条平行于坐标轴横轴的直线时说明此时柱子已经洗干净，可以进行上样检测。

（2）收集器调试。

①准备工作。将电源线、试管盘、竖杆、安全阀、漏液报警板等正确安装和固定好。开启电源，试管盘自动复位至起点，液晶显示屏亮，全中文显示。按任意键，进入待机状态。

②滴头定位。调节滴头到第一个试管的中心位置（外圈第一管），拧紧三个固定螺丝，（竖杆固定螺丝，安全阀固定螺丝，小横杆固定螺丝），完成滴头定位。

③参数设置。设置起始管号和终止管号，设置起始时间和终止时间，设置收集时间1分钟1管的速度收集。

2.2.4 样品上样

当层析住表面的缓冲液快干时用滴管取待测样品滴加到柱子表面3～4滴即可，等到待测样品逐渐向下流使柱面快干时加入洗脱液，液面始终保持高于柱面约1ml左右。

关闭梯度混合仪的混合输出阀门（旋转方向向左），将浓缩溶液倒入左杯，打开混合阀门（旋转方向向右），让溶液经过通道渗入右杯，立即关闭混合阀门。将另一稀释溶液倒入右杯，使两杯液位相同，然后在打开混合阀门，使两液面保持平衡。打开输出阀门，根据需要的斜率，缓慢调节输出流量。

2.2.5 图像绘制

如图1所示，根据电脑根据样品内不同的物质浓度绘制出图谱（若绘出的图谱出峰太小，可改变菜单中“灵敏度”选择），乙酸乙酯部分经氯仿—甲醇梯度洗脱（100：0～70：30），⑤得到A、B、C、D共4个部分。

3 实验结果

在00：02时出现了一个较高的波峰，说明这个时间出来的物质含量较高。到00：05时又一个较高的波峰，说明此时出来的物质含量很大，到00：06时波峰又达到了顶值，说明此时又有含量很大的物质流出，在00：08时波峰达到顶值，说明有大量的物质流出。到00：14后图像逐渐形成趋势于横轴的直线但存在很多的波动。此次实验说明了臭参原材在经过索氏提取法提取和萃取后的乙酸乙酯部分分离出了4个部分的活性成分。

注释

① 李树帜，叶光正.臭参的初步研究[J].云南中医学报，1994.17（4）：17-20.

② Li SZ（李树帜），Ye GZ （叶光正） 1Preliminary studie s onCodonopsis bulleya na Fore st ex Die ls. J Yunnan Col lege Tra dChin Med.云南中医学院学报，1994.17：17220.17-20.

③ Chen ZQ （陈子珺） ，Wei QH （韦群辉） ， Zhou JY （周吉燕） . Re sea rch progre ss of Chou2Shen. Yunna n J Trad ChinMed Ma ter ia Medica （云南中医中药杂志），2006.27：19220.18-21.

④ Codonopsis cordifolioidea Tsoong， Contr. Inst. Bot. Nat. Acad. Peiping 3 （3）： 95. f. 7. pl. 12. 1935; 中国高等植物图鉴 4： 774， 1975;沈联德等，植物分类学报，13（3）：62.1975.

⑤ 梅任强，吕青，胡艳芬，程永现.臭参化学成分的研究-天然产物研究与开发Na tProd ResDev 2010 ，22：2382240文章编号：100126880 （ 2010） 0220238203.