神经型一氧化氮合酶在大菱鲆脑组织中的分布及定位

韩卓然 石洪玥 孙敬锋 王一泽 邢克智

摘要：【目的】探明神经型一氧化氮合酶（nNOS）在大菱鲆（Scophthalmus maximus）脑组织中的分布情况，为揭示大菱鲆脑组织中一氧化氮（NO）的生理功能提供形态学资料。【方法】分别采用NADPH-d组织化学染色法和免疫组织化学法对大菱鲆脑组织中的nNOS进行定位研究。【结果】NADPH-d组织化学染色结果显示，大菱鲆大脑皮质中有蓝色的神经元和神经纤维存在。神经元呈梭形、锥形等形状，神经纤维呈串珠状且无序交织；小脑中NOS阳性神经元在分子层分布稀疏，在颗粒层分布密集，浦肯野细胞胞核淡染。经免疫组织化学法染色后，可观察到大脑皮质中nNOS免疫组化反应阳性物质呈深棕色；小脑皮质的分子层、颗粒层及浦肯野细胞层均有nNOS阳性神经元分布，浦肯野细胞呈免疫组织化学阳性反应。【结论】大菱鲆脑组织中的NOS类型主要限于nNOS，且nNOS在神经活动中发挥重要作用，也进一步证实NO在不同物种中具有一些共同的作用，但不同物种或相同物种不同组织中NO分布及含量存在差异。

关键词： 大菱鲆；神经型一氧化氮合酶（nNOS）；一氧化氮（NO）；脑组织；分布；免疫组织化学定位

中图分类号： S965.399 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0296-05

0 引言

【研究意义】一氧化氮（NO）是一种效应分子和细胞信使分子，其结构简单，具有反应性强、易扩散、性质活泼不稳定、生物半衰期非常短等特点，广泛存在于生物体内的各组织器官中，参与机体的多种生理及病理过程（邬晓敏和金成，2005）。在NO生成过程中，一氧化氮合酶（Nitric oxide synthases，NOS）是必不可少的酶，根据其存在的细胞类型可分为3种亚型（梁润梅，2003；马倩倩等，2013）：第一种是神经型一氧化氮合成酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS），存在于神經元和神经纤维中，其主要生物效应是在细胞间传递信息，具有传递和调节介质的作用；第二种是诱导型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS），主要存在于巨噬细胞、小胶质细胞、血管平滑肌细胞和血管内皮细胞中，iNOS在正常生理条件下不表达，只有在脂多糖、细胞因子、细菌和病毒刺激下才被激活表达；第三种是内皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS），主要分布在血管内皮细胞中。因此，对大菱鲆（Scophthalmus maximus）脑组织NOS进行定位研究，可为揭示大菱鲆脑组织中NO的生理功能提供形态学资料。【前人研究进展】自Hope等（1991）提出神经元性依赖还原型辅酶Ⅱ黄递酶（NADPH-d）即NOS后，国内外学者便开始采用NADPH-d组织化学染色法研究NOS在神经系统内的细胞定位。随着对NOS分子生物学性质认识的不断深入，发现NOS与NADPH-d尚存在许多本质性的差异，如分子量、氨基酸序列和酶活性结构域等，利用NADPH-d组织化学法也无法区分NOS的3种亚型。而免疫组织化学法是利用抗原与抗体结合的特性，能准确区分NOS的亚型。已有学者利用NADPH-d组织化学染色结合免疫组织化学方法证实，在高等动物中枢神经系统中存在nNOS，由nNOS催化产生的NO在神经系统的信息传导和生理活动中发挥调节作用（梁闰梅，2003；Singru et al.，2003，2007；Salchner et al.，2004；Yu et al.，2013）。但在现有的相关研究中，其对象主要是人类及鼠、兔、猪等哺乳动物，研究重点也多集中于患病、应激等特殊情况下nNOS的表达及其表达对机体生理机能的影响（Mishra et al.，2006；Rao et al.，2011；Ling et al.，2012；张朝再等，2014；Zou et al.，2015），仅有少数针对鱼类nNOS定位研究的报道，如马倩倩等（2013）、Biswas等（2015）分别对半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Gunther）、鲤鱼（Cyprinus carpio）脑组织中nNOS进行免疫组织化学定位。【本研究切入点】nNOS在脑组织中参与了化学信号感受、运动、内脏活动、神经调节等复杂的生理过程（Aley et al.，1998；王晓安等，2007），且不同种类动物nNOS的分布及表达量差异显著，但此类研究在鱼类中开展得相对较少。【拟解决的关键问题】运用NADPH-d组织化学染色和免疫组织化学两种方法对大菱鲆脑组织nNOS的分布及定位进行研究，揭示大菱鲆脑组织中NO的生理功能，也为不同鱼类nNOS研究提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用大菱鲆购自天津市西青区王顶堤水产品批发市场，健康无病，体长32.1 cm，体重550.0 g。β-NADPH、NBT、三卡因购自美国Sigma公司；MS-222、Triton X-100、L-多聚赖氨酸、苏木素染剂购自北京鼎国生物技术有限公司；一抗（兔抗小鼠nNOS）、二抗（山羊抗兔IgG）购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根酶标记链亲和素、DAB/H2O2染色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1. 2 样品采集及处理

将大菱鲆用MS-222进行麻醉，然后用100 mL生理盐水快速冲洗鱼体表面。在冰盘上取出脑组织，置于4%多聚甲醛中固定5 h，然后移入20%蔗糖磷酸缓冲液中浸泡至组织沉底，-20 ℃保存备用。

1. 3 NADPH-d组织化学染色

冷冻切片（厚度为15 μm）用PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min；于37 ℃下β-NADPH孵育液（0.3% Triton X-100、1 mg/mL NBT、0.6 mg/mL β-NADPH、0.1 mol/L PBS）孵育3 h；然后将切片移入蒸馏水中15 min；常规脱水、透明、封片。

1. 4 免疫组织化学定位

切片在3%过氧化氢—甲醇溶液中37 ℃孵育30 min，以阻断内源性酶活性；再经10%正常山羊血清恒温（37 ℃）封闭10 min；切片滴加稀释后的一抗（兔抗小鼠nNOS），置于4 ℃冰箱内孵育过夜，再用生物素标记山羊抗兔IgG孵育1 h；随后将辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液滴加到各冰冻切片的组织上，37 ℃恒温箱孵育30 min。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。经DAB/H2O2染色后用苏木素复染，蒸馏水冲洗，常规脱水、透明、封片。阴性对照以PBS代替一抗。

2 结果与分析

2.1 NADPH-d组织化学染色结果

从NADPH-d组织化学染色的大菱鲆大脑组织中，可观察到染成蓝色的神经纤维相互无序交织（图1-a），神经纤维部分呈串珠状，神经元细胞核着色较浅，能清楚看到突触（图1-b）。蓝色的神经元呈梭形或锥形等多种形状，呈阳性反应的神经元胞浆可观察到明显的蓝色颗粒物质（图1-c）。小脑分子层中蓝色神经元细胞分布稀疏（图2-a），而颗粒层神经元细胞分布密集，呈颗粒状，均染成蓝色。浦肯野细胞胞核淡染，胞质被染为蓝色，呈阳性（图2-b）。

2. 2 免疫组织化学定位结果

经免疫组织化学染色，大菱鲆脑组织中的nNOS免疫组化反应阳性物质呈深棕色。在大脑皮质可观察到nNOS免疫组化反应阳性神经元和神经纤维，均呈深棕色，神经纤维相互交织呈网状（图3）。小脑皮质的分子层、颗粒层及浦肯野细胞层均有nNOS阳性神经元分布（图4-a），浦肯野细胞呈免疫组织化学阳性反应（图4-b）。

3 讨论

NO是一种特殊的神经信息物质，在信息传递、神经发育、介导兴奋性毒性、调节神经再生等生理过程中发挥着不可替代的作用（邬晓敏和金成，2005）。内源性NO是由L-精氨酸经过NOS催化作用而產生，形成了一个NO-NOS体系，因此NOS分布情况可揭示组织中NO的作用部位（Gourdon et al.，2001）。本研究结果表明，大菱鲆脑组织经NADPH-d组织化学染色后，可观察到大量呈阳性反应的神经纤维和神经元。陈小囡等（2002）通过NADPH-d组织化学染色，发现NOS阳性神经元在鳙（Aristichthys nobilis）的小脑部分十分密集，神经元胞体体积较大，呈三角形、圆形或卵圆形。大菱鲆和鳙同为硬骨鱼类，在亲缘关系上距离较近，致使nNOS在两种鱼类脑部的分布情况十分相似。王晓安和蒋小满（2005）对口虾蛄（Oratosquilla oratoria）进行NADPH-d组织化学染色，发现其脑神经节中并无NADPH-d阳性细胞胞体存在，但有少量来自腹神经链的阳性纤维进入脑神经节。虽然大菱鲆与口虾蛄同为海生动物，但两种生物的亲缘关系较远，故导致其神经系统NOS阳性细胞分布存在较大差异。

由于NADPH-d组织化学染色法无法直接区分NOS的3种亚型，为此本研究同时采用免疫组织化学法对nNOS进行定位，结果表明，大菱鲆大脑皮质及小脑皮质的分子层、颗粒层和浦肯野细胞层均存在nNOS，故推断nNOS作为神经分子参与了神经调节过程。沈伟哉等（2002）以大鼠脑干为研究对象，应用免疫组织化学法进行定位，结果发现nNOS免疫组化阳性神经元呈棕褐色，细胞核淡染，阳性神经元胞体呈梭形、三角形或圆形等形状，有一个或多个突起；nNOS免疫组化阳性纤维呈棕色串珠状，且交错分布。马倩倩等（2013）通过免疫组化的方法研究发现，nNOS位于半滑舌鳎大脑神经元胞浆内，阳性神经纤维相互交织呈网状；小脑颗粒层有nNOS阳性神经元分布，分子层内可观察到阳性神经纤维和浦肯野细胞。以上研究结果在本研究中得到进一步证实。但孙虎山等（2005）研究发现，栉孔扇贝（Chlamys farreri）神经系统内nNOS免疫组化染色均呈阴性，可能是栉孔扇贝为低等动物种类，且不同种类动物、不同组织的nNOS分布及数量存在差异所致。

4 结论

大菱鲆脑组织中的NOS类型主要限于nNOS，且nNOS在神经活动中发挥重要作用，也进一步证实NO在不同物种中具有一些共同的作用，但不同物种或相同物种不同组织中NO分布及含量存在差异。

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（責任编辑 兰宗宝）