氮素对甘蔗脯氨酸合成积累及其关键基因的效应分析

杨善 王熙乾 叶昌辉 谢平 黄兴 周鸿凯

摘 要 探究2种水分条件下，氮素对甘蔗脯氨酸合成积累的效应，为甘蔗生产中氮素的施用提供理论参考。以粤糖55为材料，采用桶栽试验，在2种水分条件下，测定4个氮素水平间的脯氨酸含量、叶绿素含量、P5CS与δ-OAT活性及其基因表达，以及有效茎数、茎径、株高、蔗茎产量、锤度的表现值。结果表明：随施氮水平的提高，干旱胁迫下，叶绿素、脯氨酸的含量及δ-OAT、P5CS基因表达量逐渐提高，δ-OAT、P5CS活性先增后降；正常水分下，叶绿素含量不断增加，脯氨酸含量、P5CS活性、δ-OAT活性不断下降。有效茎数、株高、蔗茎产量等性状随着氮素水平的增加而增加，而茎径、 糖锤度则是先增后降。 通过分析结果认为， 在过磷酸钙（P肥）、 氯化钾（K肥）施用量分别固定为1 800、750 kg/hm2时，砖红壤土尿素（N肥）施用量在456～918 kg/hm2范围内最佳，甘蔗抗逆性不断增强，产量不断增加，糖分高但呈下降趋势。

关键词 氮肥；甘蔗；脯氨酸；P5CS；δ-OAT；产量

中图分类号 S566.1 文献标识码 A

Effects of Nitrogen on Proline Biosynthesis and

Accumulation and Key Gene Expression in Sugarcane

YANG Shan，WANG Xiqian，YE Changhui，XIE Ping，HUANG Xing，ZHOU Hongkai*

College of Agriculture， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088， China

Abstract The effects of nitrogen on proline biosynthesis and accumulation were explored under two kinds of water conditions in order to provide references for nitrogen application in sugarcane production.The sugarcane variety YT-55 plants were cultivated in buckets. Under normal water and drought stress conditions and the four levels of nitrogen， the physiological and biochemical indices were tested such as the gene expression and activity of P5CS， δ-OAT， proline content and chlorophyll content. As well as the performance values of effective stalks， stalk diameter， plant height， cane yield and brix were tested too. With nitrogen levels improving， the chlorophyll content， proline content and the gene expression of δ-OAT and P5CS were gradually improved， the activity of δ-OAT and P5CS had first increasing trend then decreasing trend under drought stress. Under normal water condition， the chlorophyll content was gradually improved， but proline content， the activity of P5CS and δ-OAT were gradually decreased with nitrogen levels improving. The production traits were increased such as effective stalks， plant height and cane yield with nitrogen levels increasing， but stalk diameter and brix had first increasing trend then decreasing trend. The results of analysis showed that in P and K fertilizer application amount fixed for 1 800 kg/hm2 potassium chloride， 750 kg/hm2 calcium superphosphate respectively， the best N fertilizer application amount should be within range of 456-918 kg/hm2 urea in latosol soil， drought resistance and yield of sugarcane was growing， sugar content was high but showed a downward trend.

Key words Nitrogen fertilizer；Sugarcane；Proline；P5CS；δ-OAT；Yield

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.012

随着中国经济的发展，人地矛盾日益突出，使得蔗区逐步向缺水且无灌溉条件的旱坡地和偏远山区转移。由于这些地区常发生的春、秋、冬旱，从而引起甘蔗出苗困难、生长受阻，严重影响甘蔗产量及糖分积累。在干旱胁迫下，甘蔗会发生叶片卷曲、叶面积减小、气孔关闭、水分蒸腾减少等变化，这与甘蔗的御旱性有关[1]。耐旱适应反应中渗透调节方面的研究最多，为适应干旱胁迫，甘蔗体内会短时间内大量积累渗透调节物质（如脯氨酸、甜菜碱等），降低水势，以确保细胞能从外界继续吸水，保证植株正常生长[2]。陈如凯等[3]认为干旱条件下脯氨酸积累可作为甘蔗选育抗早品种的有效指标。一般认为脯氨酸的生物合成途径有谷氨酸途径（Glu→Pro）和鸟氨酸途径（Orn→Pro），而2个合成途径的调控关键酶分别为P5CS（△1-毗咯琳-5-羧酸合成酶）和δ-OAT（δ-鸟氨酸转氨酶）[4]。黄诚梅等[5]用3个甘蔗品种以PEG胁迫1～6 d模拟干旱胁迫，结果表明，胁迫条件下甘蔗叶片的脯氨酸含量具有明显上升的趋势，P5CS活性显著提高，但δ-OAT活性变化不明显，表现为品种间的差异显著。

氮（N）是植物所必需的、首要的大量元素，是氨基酸、叶绿素、核物质、酶、生物激素等生命物质的重要合成原料，参与酶、辅酶和辅基如NAD+、NADP+、FAD+等的构成[6]。同种作物在不同生育期的需氮量不同，不同施氮方式对作物氮素的吸收有不同影响。蓝立斌等[7]的研究结果表明，甘蔗氮肥施用按基肥、分蘖肥、攻茎肥分3次施用，对甘蔗生理生化性状有积极的影响，能持久保持较强的生理优势。张立新等[8]研究认为水分胁迫下，施用氮肥能显著提高玉米的硝酸还原酶活性及脯氨酸、甜菜碱和可溶性蛋白质含量，改善氮代谢。因此，氮素水平能影响甘蔗的抗逆性。

前人着重于不同氮肥水平对甘蔗产量、品质和农艺性状的影响研究[9-10]，而氮素对脯氨酸积累及其合成酶活性、基因差异表达及产量效应的研究尚未见报道。本研究在正常水分和干旱胁迫下，设4个施氮水平，测定甘蔗叶片δ-OAT活性、P5CS活性、脯氨酸含量及叶绿素含量等抗逆性生理指标，以及株高、重量、茎数、茎径、锤度等产量、品质性状等的表现值，比较不同氮素水平间的差异，以期为粤西甘蔗耐旱、高产栽培技术的创新提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以粤糖55（粤西蔗区主栽品种之一）为材料，试验土壤为砖红壤土，其部分理化性质如下：pH值为5.08，碱解氮为152.12 mg/kg，速效钾为158.56 mg/kg，有效磷为53.27 mg/kg，有机质为27.80 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 本试验为桶栽试验（胶桶高50 cm、口径40 cm，距桶底10 cm处侧面开4个对称的排水小孔），每桶装25 kg土壤，种植2个双芽段。在施用钾肥（氯化钾）750 kg/hm2和磷肥（过磷酸钙）1 800 kg/hm2的水平上（该施肥量为湛江当地常用施肥量），设置4个氮肥（尿素）施用水平（记为1、2、3、4）分别为：0、456、918、1374 kg/hm2（918 kg/hm2为湛江当地常用施肥量），每种肥料施用量按每公顷9万芽进行换算，每桶按4芽施肥。采用随机区组试验设计，3次重复。试验处理设置2个生长条件：①土壤含水量>18%作为正常条件；②土壤含水量<8%时（甘蔗出现枯萎）作为干旱胁迫。

试验地点：广东海洋大学农业生物研究所。2013年6月18日开始种植，按计划施肥量施用全量的磷肥、半量的氮肥和钾肥，肥料与土壤充分混匀，施肥在20～30 cm土层内，齐苗后定苗，每桶选留对称且健壮的2株甘蔗幼苗，用自来水浇灌，保持土壤湿润；于2013年9月10日追肥（将计划施肥量的另一半氮肥和钾肥全部施入）。2013年11月30日，实测土壤含水量为（18.65±1.32）%时，每桶取一株甘蔗苗进行测试分析，采集其+1叶进行脯氨酸含量、δ-OAT酶活性、P5CS酶活性的测定，取其心叶进行作为总RNA提取材料。随后，将试验桶栽甘蔗移入玻璃温室内，停水管理，进行6 d干旱胁迫处理，当甘蔗叶片开始出现萎焉时（2013年12月6日，实测土壤含水量为（7.35±0.57）%，按上述方法取样、测试分析。甘蔗产量构成性状及锤度测定于2014年1月12日进行。

1.2.2 测定项目及方法 脯氨酸含量的测定按Bates等[11]的方法；叶片色素含量提取采用乙醇-丙酮混合液浸泡法[12]；P5CS提取参照Hayzer等[13]的方法，活性测定参照韩晓玲[14]的方法，一个酶活性单位（1U）定义为每分钟生成1 μmol γ-谷氨酰胺所需要的酶量；δ-OAT的抽提、活性测定参照余光辉等[15]的方法，一个酶活性单位（1U）定义为每小时生成1 mmol P5C所需要的酶量。总RNA提取采用TRNzo-lA+总RNA提取试剂盒，反转录采用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，2种试剂盒均购自天根生化科技公司；引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）用Takara宝生物公司的SYBRRPremix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒；仪器使用Roche LightCyclerR2.0；基因表达分析采用2-△△Ct法[16]进行分析，以正常水分条件下的基因表达量定义为1。

引物设计：利用引物设计软件Primer Premier 5.0，按照GenBank中甘蔗P5CS基因的cDNA序列（EU005373.2）、甘蔗δ-OAT基因的cDNA序列（EF517495.1），并根据RT-qPCR的引物设计原则进行设计，最终筛选出特异性好、无引物二聚体的引物，分别为P5CS基因的引物（F：5′-GTGGGTGT

TGAAGGTCTC-3′，R：5′-AGGAAGGTTCTTATGG

GT-3′）和δ-OAT基因的引物（F：5′-GAGTTTAGG

GACCAGTTACAGAA-3′，R：5′-AAGCAGGAGAT

AGAGCGTCAT-3′）。其中，内参基因引物则引用阙友雄等[17]筛选的25SrRNA引物（F：5′-GCAGCCA

AGCGTTCATAGC-3′，R：5′-CCTATTGGTGGGTGA

ACAATCC-3′）。

1.3 数据统计分析

应用统计分析软件SPSS19.0分析试验数据，用Duncans法分析不同氮肥水平间测定指标的差异显著性（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 叶绿素含量分析

由图1可知，在2种水分条件下，叶绿素含量随氮素水平的增加而增加；施氮水平1～2时，叶片叶绿素含量无显著性差异；在水平2～3时，叶绿素含量急剧增加，相对于水平1，正常水分时叶绿素含量增加了28.4%，干旱胁迫时则增加了34.8%。这表明氮素施用量对甘蔗叶片的叶绿素含量有显著性影响。

2.2 游离脯氨酸含量分析

由图2可知，在2种水分条件下，因施氮肥水平不同，脯氨酸含量有显著性差异，表明不同施氮量对脯氨酸含量有显著的影响。干旱胁迫下，施氮水平1～4时，脯氨酸的含量随氮水平的增加而增加。施氮水平2、3、4与水平1相比较，脯氨酸增加量分别为90.7%、116.44%、141.52%，增幅越来越小。正常水分下，施氮水平1时，脯氨酸含量最高，而水平4时最低。并且各个施氮肥水平下，脯氨酸含量均有显著性差异。由此表明，氮素对甘蔗的正常生长发育有显著性影响，若缺氮，会引起氮素胁迫，使得叶片脯氨酸含量增加。

2.3 δ-OAT活性分析

由图3可知，在2种水分条件下，δ-OAT活性均呈现先增后降的趋势，在施氮水平2时最大，水平4时最小。在正常水分条件下，只有施氮水平1与其他水平间有显著性差异，说明氮素会显著性地影响δ-OAT活性。而干旱胁迫下，δ-OAT活性比正常水分下都有显著性地增加，说明此时渗透胁迫是引起δ-OAT活性增强的主要因素，同时氮素也有一定的影响。

2.4 P5CS活性分析

由图4可知，在正常水分下，P5CS的活性随着氮肥施用量的增加而缓慢下降，只有施氮肥水平1与其他水平间有显著性差异，其他水平间无显著性差异。在干旱胁迫下，P5CS活性整体显著性高于正常水分下的值，说明干旱胁迫显著性地激活了P5CS活性，呈先增后降的趋势。在施氮水平2时，P5CS活性最高，水平4时最低。由此表明，在2种水分条件下，氮肥施用量对P5CS的活性均有显著性影响。

2.5 总RNA提取验证及引物筛选

对提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰完整，无明显的拖尾现象（图5），表明总RNA样品比较完整，无明显降解。

以反转录后的cDNA为模板，用上述基因P5CS、δ-OAT的引物进行PCR扩增。PCR产物用3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测（图6），结果显示，PCR产物条带单一，无引物二聚体出现，片段大小符合qRT-PCR的要求。同时，回收PCR产物并测序，通过Blast比对，结果为目的基因片段。

2.6 δ-OAT、P5CS基因表达分析

图7、8可知，随着施氮肥水平增加，δ-OAT和P5CS基因相对于正常水分条件下的表达量均呈现递增的趋势。在施氮肥水平1时，2个基因的相对表达量都最小，与水平2时的基因表达量没有显著性差异。而施氮肥水平4时，2个基因相对表达量均最大。由此表明，氮肥的施用量对δ-OAT、P5CS基因的表达有显著性影响。同时，2个基因的表达量均在施氮肥水平3时才显著性地增加，说明施氮肥量不足，不利用δ-OAT、P5CS基因表达，继而影响到δ-OAT、P5CS活性，最终制约脯氨酸的合成与积累。

2.7 甘蔗产量性状及锤度分析

由表1可知，随着氮肥水平的提高，有效茎数、株高、蔗茎产量均呈现递增趋势，茎径、锤度则呈现先增后降趋势。蔗茎产量在氮肥水平1～3上均呈现显著性差异，说明氮肥对甘蔗产量提高有显著的影响。在氮肥水平1～2内，蔗茎产量增加了77.2%；在水平2～3内，蔗茎产量增加13.3%；在水平3～4内，蔗茎产量增加了4.7%。上述结果表明，不施氮肥会使甘蔗产量大减，同时随着氮肥施用量增加，产量增加幅度越来越小。有效茎数在相邻施氮肥水平间均无显著性差异；甘蔗的茎径、平均株高在施氮肥水平2～4间均无显著性差异，但与水平1却有显著性差异；甘蔗锤度在氮肥水平2时最大，水平1时最小，水平1与其它水平下的锤度有显著性差异。上述结果表明，氮肥水平对有效茎数、茎径、株高、锤度均有显著的影响。

3 讨论与结论

氮素与植物的叶绿素含量、生长发育、光合作用速率及产量密切相关。有研究结果表明，在一定范围内，增施氮肥，能够提高作物的生长速率、光合速率和产量[18]。本试验结果表明，在氮肥不足时，甘蔗生长发育受到影响，叶绿素含量、茎径、有效茎数、产量、株高都下降，品质也差。叶绿素含量、蔗茎产量随着氮施用量的增加而增加，但增幅越来越小，918 kg/hm2与1 374 kg/hm2间的叶绿素含量、产量未达到显著性差异；而锤度在施氮肥为456 kg/hm2时最大，随后降低，与918 kg/hm2间的锤度未达到显著性差异。因此，氮肥的施用量应为456～918 kg/hm2范围内最佳，此时叶绿素含量、产量不断增加，糖分较高但呈下降趋势。此结论与张跃彬等[10]、 蓝立斌等[19]、 周正邦等[20]的研究结论相似。

在干旱胁迫下，脯氨酸可调节细胞的渗透势，稳定蛋白的结构，并能在胁迫解除后作为氮素和碳架为植物提供能源[21]。其中P5CS与δ-OAT分别是脯氨酸合成2个途径的关键酶，调控脯氨酸的合成。相关研究结果表明，已成功获得转P5CS基因的拟南芥[22]、 烟草[23]、 甘蓝[24]植株及转δ-OAT基因的水稻[25]植株，均有增强植株抗逆性的表现。因此，δ-OAT、P5CS活性及其基因表达量的高低对于游离脯氨酸的合成积累，提高作物的抗逆性至关重要。本研究在干旱胁迫下，δ-OAT、P5CS活性均在施氮肥量为456 kg/hm2时最大，再增加施氮量则活性下降；而456 kg/hm2与918 kg/hm2水平间的P5CS活性无显著性差异，说明在施氮量为456～918 kg/hm2，有利于提高δ-OAT、P5CS活性。δ-OAT、P5CS基因表达量、脯氨酸含量则是随着氮肥施用量增加而增加，说明干旱胁迫、氮肥水平均可上调δ-OAT、P5CS基因的表达，以增加脯氨酸的合成。施氮肥水平0与456 kg/hm2间，δ-OAT、P5CS基因表达间无显著性差异，脯氨酸含量则是急剧地增加，增幅最大；大于456 kg/hm2时，基因表达量、脯氨酸含量都显著增大，但此后脯氨酸含量的增幅越来越小。因此，干旱胁迫下，施氮肥量为918 kg/hm2时，最有利于δ-OAT、P5CS活性及基因表达、脯氨酸合成。然而δ-OAT、P5CS活性与其基因表达之间的变化趋势并不一致，可能是基因从表达到成功翻译受到许多因子调控，如钝化蛋白[26]、相关降解酶[27]对酶活性进行调控。而在正常水分下，在施氮量为456～1 374 kg/hm2间，δ-OAT、P5CS活性及脯氨酸含量虽呈现缓慢下降趋势，但各个水平间均未达到显著性差异。上述结果表明，此时施氮肥量为456 kg/hm2即可，δ-OAT、P5CS活性也未被显著激活，脯氨酸含量较低，植株并未受到缺氮胁迫，符合环保与经济性的原则。综上所述，本研究在过磷酸钙、氯化钾的施用量分别为1 800、750 kg/hm2时，砖红壤土尿素施用量在456～918 kg/hm2范围内最佳，随着氮肥施用量增加，甘蔗抗旱能力不断增强、产量不断增加，糖分高但呈下降趋势。具体施肥量还与田间水、肥管理水平密切相关。

参考文献

[1] 张跃彬. 现代甘蔗糖业[M]. 北京： 科学出版社， 2013： 12-15.

[2] 夏红明， 赵培方， 刘家勇，等. 干旱胁迫对甘蔗保护酶活性等生理指标的影响[J]. 西南农业学报， 2013， 26（5）： 1 824-1 828.

[3] 陈如凯， 张木清， 陆裔波. 干旱胁迫对甘蔗生理影响的研究[J]. 甘蔗， 1995， 2（1）： 1-6.

[4] Kishor P B K， Sangam S， Amrutha R N， et al. Regulation of proline biosynthesis， degradation， uptake and transport in higher plants： its implications in plant growth and abiotic stress tolerance[J]. Current Science， 2005， 88（3）： 424-438.

[5] 黄诚梅， 毕黎明， 杨丽涛，等. 聚乙二醇胁迫对甘蔗伸长期间叶中脯氨酸积累及其代谢关键酶活性的影响[J]. 植物生理学通讯， 2007， 43（1）： 77-80.

[6] 陆景陵， 胡霭堂. 植物营养学[M]. 北京：高等教育出版社，2006： 23-32.

[7] 蓝立斌， 陈超君， 米 超，等. 不同施氮方式对甘蔗生理生化性状的影响[J]. 南方农业学报， 2011， 42（1）： 26-29.

[8] 张立新， 李生秀. 水分胁迫下氮、钾对不同基因型夏玉米氮代谢的影响[J]. 植物营养与肥料学报， 2007， 13（4）： 554-560.

[9] 刀静梅， 郭家文， 崔雄维，等. 不同供氮水平对甘蔗产量和品质的影响[J]. 中国糖料， 2011， 18（2）： 22-23.

[10] 张跃彬， 樊 仙，刀静梅. 不同氮水平对甘蔗生长的影响[J]. 中国糖料， 2013， 20（3）： 15-17.

[11] Bates L S， Waldren R P， Teare I D. Rapid determination of free proline for water-stress studies[J]. Plant and Soil， 1973， 39（2）： 205-207.

[12] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000： 164-165.

[13] Hayzer D J， Leisinger T. The gene-enzyme relationships of proline biosynthesis in Escherichia coli[J]. Journal of General Microbiol， 1980， 118（6）： 287-293.

[14]韩晓玲. 小冠花抗L-羟基脯氨酸（Hyp）变异系离体筛选及其耐盐性研究[D]. 西安： 西北大学， 2006： 21-22.

[15] 余光辉， 刘正辉， 曾富华，等. 脯氨酸积累与其合成关键酶活性的关系[J]. 湛江师范学院学报， 2002， 23（6）： 57-70.

[16] Licak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta Ct）method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[17] 阙友雄， 许莉萍， 徐景升，等. 甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择[J]. 热带作物学报， 2009， 30（3）： 274-278.

[18] 钟希琼， 林丽超. 旱胁迫对不同春小麦叶绿素含量的影响及与抗旱性的关系[J]. 佛山科学技术学院学报， 2002， 20（3）： 68-90.

[19] 蓝立斌， 陈超君， 米 超， 等. 不同施氮量对甘蔗生理性状、产量和品质的影响[J]. 广西农学科学， 2010， 41（12）： 1 269-1 272.

[20] 周正邦， 易代勇， 龚德勇，等. 氮肥对高糖甘蔗品种的增效作用[J]. 贵州农业科学， 2009， 37（8）： 65-66.

[21] 王丽媛， 丁国华， 黎 莉. 脯氨酸代谢的研究进展[J]. 哈尔滨师范大学自然科学学报， 2010， 26（2）： 84-88.

[22] 陈吉宝， 赵丽英， 毛新国， 等. 转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应[J]. 作物学报， 2010， 36（1）： 147-153.

[23] 张 霞， 唐 维，刘 嘉，等. 过量表达水稻OsP5CS1和OsP5CS2基因提高烟草脯氨酸的生物合成及其非生物胁迫抗性（英文）[J]. 应用与环境生物学报， 2014， 20（4）： 717-722.

[24] 李鸿雁，李大红. 转拟南P5CS1基因增强羽衣甘蓝的耐旱性[J]. 植物生理学报， 2014， 50（7）： 1 009-1 013.

[25] 吴亮其， 范战民， 郭 蕾，等. 通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻[J]. 科学通报， 2003， 48（19）： 2 050-2 056.

[26] 刘 丽， 甘志军，王宪泽. 植物氮代谢硝酸还原酶水平调控机制的研究进展[J]. 西北植物学报， 2004， 24（7）： 1 355-1 361.

[27] Igarashi Y， Yoshiba Y， Takeshita T. Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding proline transporter in rice[J]. Plant Cell Physiol， 2000， 41（6）： 750-756.