人结直肠癌BRAF基因V600E突变的检测方法

摘要：为了探讨人结直肠癌BRAF基因V600E突变的检测方法，文章通过等位基因特异性扩增技术检测80例结直肠癌石蜡标本的BRAFV600E突变性，且与Sanger测序法进行对比，得出结论：通过等位基因PCR技术检测人结直肠癌BRAF基因V600E突变，与测序法对比灵敏度、简便性、快速性更高，对人肿瘤BRAFV600E突变具有较高的筛查价值。

关键词：人结直肠癌；等位基因；特异性扩增；BRAF基因；V600E突变 文献标识码：A

中图分类号：R735 文章编号：1009-2374（2016）24-0072-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.24.036

目前，临床中有超过30种BRAF突变类型，大约90%突变处在第15外显子，而V600E突变则是最为常见的一种突变。本文将人BRAF基因V600E突变位点作为等位基因特异性扩增引物，经等位基因特异性扩增技术检测且与金标准Sanger测序法，分析其可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选用的人大肠癌SW480、HT29细胞均通过测序显示为BRAF野生型、携带BRAFV600E杂合突变。80例结直肠癌标本均由医院病理科提供。其DNA肿瘤组织切片通过镜检显示肿瘤细胞水平超过90%。

1.2 方法

提取DNA，并将模板DNA放置到-20℃环境内保存。等位基因特异性扩增法：将人大肠癌细胞株SW480、HT29与80例肿瘤标本予以等位基因特异性扩增，PCR体系总体积是20μL ，含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有0.5μL（10μmol），模板DNA30ng，置入灭菌去离子水达到20μL。通过95℃预变性30s；95℃变性10s；67℃退火20s；72℃延伸30s，总45个循环进行反应。将肿瘤标本取出1μL进行第一次扩增，并将其产物用作二次扩增物，采用同样扩增方法。将PCR产物采集5μL实施琼脂糖（2%）凝胶电泳，持续30min，然后予以显像。

标本与细胞株均通过PCR测序且对比等位基因特异性扩增的结果。PCR反应条件为：含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有1μL（（10μmol），模板DNA30ng，置入灭菌去离子水达到20μL。通过95℃预变性30s；95℃变性10s；54℃退火20s；72℃延伸30s，总40个循环。将PCR产物通过琼脂糖（2%）凝胶电泳显示目的条带扩增完成后进行测序。

采集SW480、HT29细胞株DNA，通过核酸定量仪进行定量，达到30ng，依据一定比例通过携带BRAF野生型（SW480）的核酸与包含BRAFV600E突变（HT29）的核酸相混合，获得包含50%、25%、12.5%、6.2%、3.1%、1.5%的突变DNA混合模板，然后再分别采集30ng实施等位基因特异性扩增，且对比普通PCR后测序的灵敏度。

2 结果

BRAF基因V600E突变结果经PCR条件反应，能够选择扩增出携带有BRAF基因V600E杂合突变的细胞株。80例大肠癌石蜡标本中，6例形成目的扩增产物。通过测序，74例BRAF基因15外显子1799位核苷酸是野生型，6例为BRAF基因V600E突变，此结果与等位基因特异性扩增具有一致性。经等位基因特异性扩增的不同比例突变核酸，此法可于6.2%突变基因模板内扩增目的条带，BRAF基因V600E突变的敏感度可低到6.2%。普通PCR后测序结果自峰图显现50%、25%、12.5%的突变位点，比12.5%低的与背景信号相混杂难以测出。

3 讨论

恶性肿瘤使得人类生命健康受到严重威胁，且有日益突出的趋势，寻找较为有效的，可以在早期对其进行诊断治疗的方法在医学领域已逐渐成为较为重要的研究课题，是基础与临床医学研究的热点项目。肿瘤细胞在基因组水平上与正常体细胞具有比较高的差异，是肿瘤演变及生长过程中出现稳定复制的一类具有较高重要性的驱动突变，可用作新的生物标志物，对于肿瘤的临床诊断与预后评判具有重要意义。

BRAF基因编码蛋白是丝裂原活化蛋白激通路中旳一种丝苏氨酸特异性激酶，是通路中的一个重要转导因子。目前BRAF基因检测方法主要有探针扩增阻滞突变系统（ARMS）、测序法、高分辨率溶解曲线分析技术（HRM）、限制性片段长度多态性（RFLP）、单链构象多态性分析（SSCP）和高效液相色谱法（DHPLC）等方法。BRAF基因V600E为此基因的热点突变，表现是T变为A，突变后使得编码的谷氨酸被缬氦酸所代替。对结直肠癌患者进行靶向治疗过程中显示，携带有突变使得患者使用EGFR单抗药物（西妥昔单抗、帕尼单抗）进行治疗时，无法达到较为理想的效果，而且对干预后不良是比较重要的一个标志。在毛细胞白血病患者肿瘤细胞的测序中，肿瘤细胞全携带有突变，由此可知其极有可能是导致毛细胞白血病致病的一个重要机制，而且是此疾病的一个新型的特异性诊断标志物，对于此疾病的靶向治疗提供了一个新的方向。

BRAF基因突变对于评价恶性黑素瘤，预测结直肠癌分子靶向药物的临床治疗效果具有重要意义。对BRAF基因突变进行检测时，筛选靶向药物可以获得益处的病例，对于制定理想方案具有重要意义，可有效节约成本，使得肿瘤病患达到个体化治疗。但在临床中，对样本进行检测时，肿瘤细胞具有较低的丰度，且有了大量野生型体细胞混在其中，对突变基因的准确检测具有明显的不利影响。对BRAF基因進行突变检测具有多种方法，本文利用等位基因特异性扩增检测人结直肠癌BRAF基因V600E突变。

等位基因特异性扩增在检测已知突变时较为简便，通过Taq酶缺少3→5外切酶活性，引物3末端碱基与模板出现错配时，扩增很难完成，由此可实现选择性扩增定点突变或野生型基因的目的。在本文研究中，设计上游引物3端与BRAF基因V600E点突变进行互补、与野生型碱基错配的上游引物，经优化反应，实现选择性扩增BRAFV600E突变。通过携带V600E突变的HT29细胞与BRAF野生型的SW480大肠癌细胞株的检测，显示此方法证实能够测定出混杂在野生型内的6.2%BRAF突变，与测序结果12.5%进行对比，此法灵敏度更高。由于PCR的反应体系体积通常比较低，当使用传统电极予以电化学检测时，需毫升级别的反应体积，如此使得试剂内损耗，增加成本，且导致检测敏感性减弱。测序能够对碱基位置形成直接定位且可辨别碱基具体类型，具有极高的直观性与确定性，是突变检测的一个“金标准”。Sanger测序法是DNA测序中比较经典的一种方式，基本原理为双脱氧链终止法，使用检测标记不同荧光素的DNA片段，然后经详细的数据计算获得检测的序列。但对于混合扩增产物来说，因为处于相同位置，不同碱基所呈现的信号强度并无一致性，测序分析软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，便于获得尽可能准确的结果，如此在突变模板比例比较低时，测序系统通常会显示突变信号峰是一种背景信号，使得此结果持续压低。近些年来，此基因突变对于大肠癌、恶性黑素瘤的分子靶向药物具有较高的治疗效果预测作用，且此指标逐渐得到人们的重视。因为靶向药物在使用过程中，通常价格比较昂贵，而且具有较为显著的毒副作用，所以采用具有较高准确性、敏感性的指标对治疗效果的基因突变情况予以检测并明确判定存在显著指导意义。但是一部分晚期肿瘤患者在初诊时错过了手术治疗时机，对肿瘤源性的突变基因进行检测时只可使用穿刺组织活检、胸腹水等方式。而且在临床中通过测序进行检测能够防止假阴性的存在，通常不会收取肿瘤细胞水平小于50%的标本，由此使得一些晚期肿瘤患者采用靶向治疗时并无可以遵循的依据。通过本文的研究，检测80例大肠癌石蜡标本，测到6例，与PCR后测序结果具有一致性。建立突变富集ARMS荧光定量PCR法能够检测到101拷贝/反应，显示较高的灵敏性及分辨率，可于肿瘤样本存在较少突变细胞时检测到突变的等位基因，应用前景良好。

总之，等位基因特异性扩增能够快速测到肿瘤BRAF基因V600E突变，与测序法进行对比，此法不需特殊设备，简便性、快捷性、灵敏性、经济性高，值得推广应用。

参考文献

[1] 司徒博，曹楠楠，刘丽琴，等.利用等位基因特异性扩增检测人结直肠癌BRAF基因V600E突变[J].中国实验诊断学，2012，16（5）.

[2] 曲守方，于婷，郭李平，等.BRAF基因V600E突变检测的荧光PCR方法的建立[J].药物分析杂志，2015，35（8）.

作者简介：徐显暑（1982-），男，浙江人，温州因美生物科技有限公司副总经理，硕士，研究方向：基因工程。

（责任编辑：王 波）