生物电子显微学技术在农业高等院校研究生教学中的应用与实践

王金泉 吴辉 王琦 翟少华

摘要：电子显微镜是一种超微结构分析精密仪器，主要用于观察被检测样品的内部结构和表面形态特征变化的研究。随着电镜功能和检测技术的不断发展，其与农学、动物医学、动物科学、园林、食品与药品、草业与环境等农学生命科学科的应用越加紧密。在农业高等院校研究生教学中开设《生物电子显微镜技术课程》，可以有效地提升各学科整体教学质量和科研能力，为提升农业高等院校教学和科研发挥着重要作用。

关键词：生物电子显微学；农业高等院校；研究生；教学

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）30-0152-02

电子显微镜是一种超微结构分析精密仪器，主要用于观察被检测样品的内部结构和表面形态特征变化的研究。随着电镜技术的不断发展与农学、动物医学、动物科学、园林、食品与药品、草业与环境等农学生命科学科的应用越加紧密[1]。在农业专业学科的教学和科研中，可通过电子显微镜对动物和植物细胞的细胞壁、生物膜、叶绿体、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、微体、中心体、细胞骨架和细胞质内含物（如糖原、脂类、蛋白质），以及细菌的特殊结构；微生物超微结构如：菌体鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜等结构、病毒的囊膜、衣壳、霉病菌菌丝和孢子等形态，以及化工材料的化学结构元素分析，含水样品、含油样品、放气样品、加热样品、冷冻样品进行观察工作。因此，在农业高等院校研究生教学中开设《生物电子显微镜技术课程》，可以有效地提升各学科整体教学质量和科研能力，为教学和科研服务。

一、《生物电子显微学技术》课程的教学内容与要求

1.《生物电子显微学技术》课程的理论教学内容。《生物电子显微镜技术》理论课程20学时，教学内容包括：电子显微镜的发展与应用、透射电子显微镜原理与制样、扫描电子显微镜原理与制样、免疫电镜细胞化学技术、冷冻切片技术与冰冻蚀刻、酶电镜细胞化学技术、电镜放射自显影技术、生物大分子电镜超微细胞化学技术、电镜原位分子杂交技术。

2.《生物电子显微学技术》课程的实验教学要求。在实验教学中要使学生掌握仪器的基本操作方法，生物样品超薄切片技术、半薄切片技术、负染技术、细胞化学定位技术、扫描电镜临界点干燥技术、离子溅射技术、细胞冰冻蚀刻技术等样品制备方法，使学生能够学会运用电子显微镜技术对动植物组织细胞超微结构和功能的研究方法和技术手段。

二、生物电子显微镜技术在农学专业研究生教学中的应用

1.免疫电镜细胞化学技术在农学专业研究生教学中的应用。免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一种方法[2]。目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术、免疫铁蛋白技术和免疫胶体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗铁蛋白电镜复合物技术。可用于农业作物抗旱、抗旱品种选育，品种间生长发育组织学特性表征抗原的定位分析；动物疾病微生物学鉴定、诊断和致病机制研究；动物组织胚胎发育，干细胞诱导发育研究，动物肿瘤的组织学诊断；林果品种发育结构特征等领域的科研研究。

2.冷冻切片技术与冰冻蚀刻在农学专业研究生教学中的应用。冷冻切片技术是利用液氮快速冷冻技术，在冷冻超薄切片机中进行冷冻切片。省去了传统的戊二醛/俄酸固定、乙醇脱水、丙酮置换等有机溶剂操作过程，避免了化学药剂的处理，样品结构、成分不发生变化，实现快速固定，快速制片、快速研究与诊断的能力，保持了细胞或组织的生物活性物质的原始状态。冷冻蚀刻技术是利用物理冷冻断裂方法对生物样品组织细胞进行断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，用透视型电子显微镜观察细胞或细胞器的内、外表面微细的三维结构或膜内微细结构分析的方法[3]。可用于动植物新鲜组织细胞的超微结构、生物大分子和某些元素在组织内分布、免疫抗原电镜标记、细胞酶活性标记、电镜放射自显影等细胞的化学和细胞成分的定量定性分析。

3.酶电镜细胞化学技术在农学专业研究生教学中的应用。电镜酶细胞化学技术是通过酶的特异性细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位技术。一般先将酶原位固定在细胞内，再使它与特定的底物起反应，底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的原位上，最后使沉着物变为在电镜下可以看到的物质。在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化还原酶和转移酶[4]。

电镜酶细胞化学技术可应用于农作物棉花、小麦、玉米、水稻等作物的生长发育、品种选育、营养成分检测等方面研究；动物生长代谢机制、不同畜禽品种间组织细胞形态学和生理生化机制差异；牛、羊等畜产品贮藏方法和无公害研究；动物超微解剖学、动物生理功能机制、动物发病机制、动物病原微生物形态、动物免疫学机制、动物药物作用机理、药物成分和结构等方面研究工作。

4.电镜放射自显影技术在农学专业研究生教学中的应用。放射自显影技术是利用放射性核素所产生的射线作用于感光乳胶的卤化银晶体而产生潜影，再经过显影定影处理，把感光的卤化银还原成黑色的银颗粒，即可根据这些银颗粒的部位和数量分析出标本中放射性示踪物的分布，以进行定位和定量分析[5]。可通过放射自显影技术定位功能，对组织样品的结构研究和目的成分检测进行分析，可应用于动物组织细胞的活性蛋白表达、活性物质的组织分布、检测物质的组织定位，以及肿瘤、免疫疾病、传染性疾病的特异性诊断；生物肥料物质的吸收及植株内的动态分布，抗旱、抗旱功能蛋白的组织内定位，组织内的原位杂交等功能研究。

5.生物大分子电镜超微细胞化学技术在农学专业研究生教学中的应用。生物大分子是构成生命的基础物质，包括蛋白质、核酸、碳氢化合物等。由于其低相对分子量的有机化合物经过聚合而成的多分子体系。生物大分子在各种生物活性和在生物新陈代谢中发挥重要作用[6]。通过电子显微镜技术可以观察生物大分子的理化特性及空间构像与功能研究；核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量；进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。应用范围涉及到生物化学、细胞生物学、微生物、遗传发育、食品、药理、生理、医学、病理、植物、神经科学等的研究工作。

6.电镜原位分子杂交技术在农学专业研究生教学中的应用。原位杂交技术是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来[7，8]。自Gall和Pardue建立了原位杂交技术以来这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病毒学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料，发挥了其他技术难以取代的作用，近年来这一技术的应用领域逐渐向电镜水平发展以提高检测的分辨率。

三、展望

电子显微镜技术在生命科学的研究和应用地位日显重要，其稳定性、操作性的改善，更高分辨率依旧是电镜发展的最主要方向。高性能场发射枪电子显微镜日趋普及和应用、电子显微镜分析工作迈向计算机化和网络化、高性能CCD相机日渐普及应用、低温电镜技术和三维重构技术等电镜新兴检测技术的发展，可以为生命科学的研究提供重要的研究工具，可以极大地提升生物形态学的发展进程。也可为农业生产、科学养殖、动物疫病、林果产业、水土资源、水利水电、化工工业的发展和科研提供技术条件，为新疆整体科研实力的提升和农业高校的学科建设与发展，提供科研平台[9，10]。

参考文献：

[1]刘学春，郭延奎，崔德才.高等林业院校生物显微镜技术教学模式的研究与实践[J].中国农业教育，2001，（06）：36-38.

[2]李文财，周常勇.免疫电显镜技术在植物病毒研究中的应用[J].南方农业，2011，（05）：84-86.

[3]朱小东，曾彩虹，刘志红.冷冻超薄切片免疫电镜技术在肾活检病理中的应用[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2013，22（03）：293-298.

[4]付宇.盐碱胁迫下星星草根H+—ATP酶超微细胞化学定位研究[D].东北林业大学硕士研究生论文，2010.

[5]范永增，袁耿彪，朱晓娥.包裹放射性核素131I的高分子纳米药物的制备及其放射性自显影实验[J].重庆医学，2012，41（12）：1203-1206.

[6]周建平.携带抗赤霉病基因的小麦-黑麦小片段易位的分子细胞学检测[D].四川农业大学硕士学位论文，2004.

[7]何玉英，李健，刘萍.原位杂交技术及其在水产养殖中的应用[J].海洋水产研究，2005，26（01）：74-79.

[8]周燕，高华，高自旸.染色体原位杂交技术与植物显微镜技术实验探索[J].生物通报，2011，46（02）：43-45.

[9]付志强，孟凯.材料电子显微镜分析技术现状与发展[J].检验检疫学刊，2009，（03）：72-74.

[10]杜三明，赵飞.探索与实践：《材料电子显微分析技术》课程的教学改革探讨与实践[J].教育教学论坛，2011，（20）：123-124.