金黄色葡萄球菌三联融合毒素的表达及免疫特性研究

王爽 曹宏伟 张春磊

摘 要：本文以金黄色葡萄球菌肠毒素为研究对象，扩增出的三个融合毒素SEA、SEB、SEE进行基因串联后，得到的融合毒素基因在表达宿主菌中得到了充分的表达，融合毒素具有良好的抗原性，抗体可以和三种融合毒素产生免疫反应，特异性较好。从而得出结论：将金黄色葡萄球菌肠毒素的扩增基因进行串联可以在原核中表达，表达后可以产生具有广谱反应特性的抗体。

关键词：金黄色葡萄球菌；融合毒素；免疫特性

金黄色葡萄球菌肠毒素是一种会引起食物中毒的细菌毒素，食品污染上这种细菌后会腐烂变质，严重时产生的肠毒素会导致食物中毒。在进行这种毒素的检测时，最开始是通过将菌体分离，确定是不是产毒株，最后判断产生毒素的方法，这种方法程序比较繁杂，不够节省时间，不能满足快速进行食品检测的要求。随着生物技术发展，进行食物中毒样品的检测分析方法越来越多，例如单克隆抗体技术、聚合酶链反应等，这些检测技术得到了越来越广泛的应用。

金黄色葡萄球菌肠毒素的基因毒素现在都可以克隆表达出来，例如A、B、E型的基因，本文分析的就是这三种基因的融合表达和免疫特性，从而为食品广谱免疫学检测方法提供一些方法方面的基础。

一、金黄色葡萄球菌简介

金黄色葡萄球菌又称为金葡菌SA，因在显微镜下呈葡萄串形而得然。金黄色葡萄球菌没有芽胞和鞭毛，其生长对营养方面的要求不高。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，分以分解为葡萄糖 、麦芽糖、乳糖等，它具有较强的抵抗力，对青霉素、红霉素非常敏感。

金黄色葡萄球菌可引起人类的化脓感染，有时还会引起肺炎、心包炎等。金黄色葡萄球菌的致病力的强弱主要取决于它产生的毒素和侵袭性的酶，如溶性毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、肠毒素等。金黄色葡萄球菌可以分泌20多种特性的蛋白质，最主要的是葡萄球菌肠毒素（SE），是由血浆凝固酶或者耐热酸酶产生的一种胞外蛋白质，根据血清类型分为A—J几种，这些肠毒素都可以引起食物中毒。下面来对金黄色葡萄球菌三联整合毒素进行表达并进行免疫特性分析。

二、金黄色葡萄球菌肠毒素基因片段的克隆

利用PCR检测方法扩增出SEA、SEB、SEE，后与载体连接构成重组质粒后转入克隆菌，提取质粒的DNA，成功克隆了SEA、SEB、SEE的结构基因，对结构基因进行电泳分析，在紫外线检测仪下观察到了非常明显的特异性条带，片断分别为SEA、SEB、SEE，片断的大小与已经存在的标准序列是相符的，没有发生突变，也未发生缺失突变，将三种毒素的基因序列克隆后进行酶切定和序列的测定分析，测定结果与文献结果的同源性全部一致，目的基因转入了受体菌中。

三、三个基因的串联表达

将克隆出来的基因片断SEA、SEB、SEE重叠延伸拼接法进行串联，获得了一条三个基因串联的肽链，与PET连接后用PET在原核中進行载体表达 ，测定结果显示串联的三个毒素在大肠肝菌中获得了表达，原核表达载体构建后转化到了受体菌，经过诱导和凝胶电脉后获得了表达蛋白质，蛋白质大小为64KU，原核表达载体可以表达较大的蛋白 ，但如果是以包涵体的形式表达，蛋白表达量更高，多个基因串联对蛋白表达的大小会有影响。表达产物的表达形成可以达到26%，并探讨了不同的诱导条件对表达效果会产生不同的影响，如果IPTG的浓度为1mmol/L，诱导时间达到4个小时，这时的表达效果是最好的。

四、三联重组毒素的抗原性分析

将表达蛋白的包涵体进行纯化，从獭兔身上制备血清抗体，经过琼脂扩散试验显示，表达的融合毒素基因有不同的抗体效价，但是保留了A、B、E三种毒素的抗原性，和非目标菌和毒素不会反应，具有特异性。包涵体没有生物学活性，但会保留免疫学的性质，用包涵体免疫獭兔作试验，产生了抗体，抗体与相应的毒素蛋白会起反应，但它具有特异性，所以这种包涵体可以作为制备细菌毒素的抗体，这样可以节约毒素或毒素替代品的使用量。在原核的表达载体中可以进行3个以上蛋白基因的串联，产生的抗体可以具备广谱抗体的意义，从而为广谱免疫检测方法的建立 提供了理论依据。

五、小结

通过对金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEE三个毒素基因片断的成功克隆，得到了与文献报道结果100%同源性的测序结果，将这三个毒素基因进行串联，构建起了三联毒素重组基因，从而充分说明了可以在原核表达载体中串联至少3个蛋白基因，2个连接基因，每年抗原可以保持原有的特性。原核表达载体以包涵体的形式进行表达 ，表达量占到了菌体总蛋白量的26%，测量了少部分的可溶性蛋白。初步提纯的包涵体可以诱导獭兔产生免疫的抗体。对三种毒素的敏感性进行测定，三种毒素都达到了ng水平，其中SEB毒素的敏感性较高。

参考文献：

[1] 雷祚荣.葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病[M].北京：中国科学技术出版社，1992.第一版.

[2] 王小红.食品中金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展.山西食品工业，2003（3）：39-42.

[3] 汪宇.金黄色葡萄球菌肠毒素A基因全序列的克隆、鉴定与扩增.贵州医药，2003，27（8）：675-678.

项目名称：《金黄色葡萄球菌CIfB/Lbp嵌合蛋白免疫原性研究》，项目编号：11541251，黑龙江省教育厅科研项目

作者简介：王爽（1982-），女，汉族，黑龙江人，职称：研究实习员，职务：检测员，研究方向：农产品质量安全。