大叶千斤拔对高温胁迫的生理响应及耐热性分析

张瑜　严琳玲　王文强　白昌军

中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部热带作物种质资源利用重点开放实验 海南儋州 571737

摘 要 以自然高温处理后的15份大叶千斤拔为材料，研究高温胁迫对叶片厚度、叶面积、叶绿素值、叶片含水量、电导率值和MDA含量等外观和生理指标的影响。通过隶属函数分析表明：材料F3和F5的植物生长表现较好；F14和F15在叶绿素含量、质膜透性、叶片含水量、MDA含量中的综合反应均较好；材料F14和F15相比其它13个材料具有较好的相对耐高温特性，而F12和F13对热相对敏感，其余9份为中等耐热材料。

关键词 大叶千斤拔；高温胁迫；耐热

中图分类号 S567 文献标识码 A

Abstract With natural high temperature treatment， taking 15 copies of F. macrophylla（Willd.）Merr. as the material in this experiment， the effects of high temperature stress on the appearance indices and physiological indices， including leaf thickness， leaf area， chlorophyll content， leaf water content， electrical conductivity and MDA content were studied. The membership function analysis showed that the plant growth performance of F3 and F5 was better， F14 and F15 exhibited better comprehensive response of chlorophyll content， plasma membrane permeability， leaf water content， MDA content， meaning relatively better high temperature resistance characteristics compared to the other 13 materials. F12 and F13 were relatively sensitive to heat， and the remaining 9 were moderately resistant to heat.

Key words Flemingia macrophylla； High temperature stress； Heat resistance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.009

千斤拔属（Flemingia Roxb.）是一类豆科植物，全世界约有40种，分布于热带亚洲、非洲和大洋洲。中国产16种及1变种，分布于西南、中南和东南各省区，在这些千斤拔种类中，分布最广的是蔓性千斤拔（F. philippinensis Merr. et Rolfe），分布于11个省（区），其次是大叶千斤拔[F. macrophylla （Willd.）Merr.]，除湖北、湖南外的云南、贵州、四川、江西、福建、台湾、广东、海南和广西等9个省（区）均产之。目前，国内外对大叶千斤拔的研究大多集中在药用价值[1]、饲料[2-6]、绿肥[7]、栽培育种[8]和分子标记[9]、生态[10-12]等方面，对大叶千斤拔抗逆性的研究尚未见报道。

植物在生长发育过程中会受到各种非生物因子的胁迫，其中温度是制约植物产量和品质的主要环境因子[13]。随着全球气温的不断上升，极端高温天气频繁发生，热胁迫严重影响植物的正常生长发育，植物的耐热性机制研究越来越受到重视[14-15]。对于耐热性鉴定的指标已有相关报道，在小白菜[16]、黑麦草[17]、茄子[18]、苦瓜[19]、观赏海棠[20]等不同作物上研究发现细胞质外渗率、丙二醛（MDA）含量、叶片含水量及叶绿素含量等指标可作为耐热性鉴定指标。本文采用田间直接鉴定法研究高温胁迫对15份大叶千斤拔的形态生长及生理指标的影响，比较耐热和热敏种质材料的变化差异，对其抗逆性遗传改良有一定意义，为探讨大叶千斤耐热机理提供更多的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地概况 试验地位于海南省西北部的中国热带农业科学院儋州院区十队基地，东经109°30′，北纬19°30′，海拔149 m，属热带季风气候区，夏秋季节高温多雨，冬春季节低温干旱，干湿季节明显。2015年全年均温25.2 ℃，最高温为8月份，极端高温48.0 ℃，月降水量142.6 mm（资料由海南省气象服务中心儋州国家气象站提供）。土质多为花岗岩发育的砖红壤，土壤肥力较差，土壤pH4.98～5.50。

1.1.2 试验材料 试验材料由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南热带牧草备份库提供（见表1）。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验于2015年进行，播种期为3月15日（常温）、穴播栽培，常规田间管理。15份大叶千斤拔材料采用随机区组设计，重复3次，株行距为80 cm×80 cm。经8月3日到8月14日连续12 d自然高温（日最高气温）40 ℃处理后，进行项目测定。

1.2.2 测定方法 利用叶绿素仪测定叶面温度和叶绿素值。于2015年8月高温期，选取晴朗无云的天气从上午8点开始，每隔2小时测定1次，到下午18点结束。测量时，选用长势均匀，生长良好的叶片进行测量。每个材料测定相同的10片叶子，测量叶片边缘部分，每个叶片测定5个点，3次重复。

确定试验的时间点后，随机取健壮的植株，从下往上数采集第3片完整叶子，一共采集10张叶片，采样后，用冰盒带回实验室，样品均置冰上快速剪成1 cm左右的小段，混匀，按各指标测定所需的叶量称取，3次重复。

1.2.3 测定项目 （1）形态指标测定。叶片厚度采用数显游标卡尺测定，叶面积利用叶面积仪进行测定。

（2）生理指标测定。电导率测定采用电导率仪法，丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法，叶片含水量采用加热烘干法测定，叶绿素含量采用SPAD502型叶绿素仪进行测定[21]。

1.3 数据分析

原始数据的整理采用Microsoft Excel 2003，方差分析采用SAS软件完成。采用模糊综合评判法，计算各参试材料的隶属函数Xn，得出15份参试材料在高温胁迫下的耐热性排序。公式为Xn=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）。式中，X为各材料某一指标的测定均值，Xmax为各材料该指标测定值中的最大值，Xmin为该指标中的最小值。将各材料耐热性指标的隶属函数值进行累加，计算其平均值即为各品种耐热型综合值，综合值越大，其耐热性越强。

2 结果与分析

2.1 高温条件下试验时间点的选择

2.1.1 不同时间点的叶片温度 叶片平均温度最低的时间点为18 ： 00，参试材料的叶面温度均低于30 ℃；叶片平均温度最高的时间点为14 ： 00，10份材料的叶片温度均高于45 ℃，其余5份材料的叶面温度高于40 ℃。供试材料F10的叶片温度最高，为49.4 ℃；F3和F4的叶面温度最低，为41.7 ℃和41.5 ℃（图1）。

2.1.2 不同时间点的叶片叶绿素含量 叶绿素是植物光合作用最重要的色素，叶片叶绿素含量的多少直接影响光合作用的强弱，因此耐热性差的植物膜脂氧化分解程度大，叶绿体降解加快，使叶绿素含量偏低，光合能力下降[22-24]。由图2可知，随着时间的推移和温度的变化，15份大叶千斤拔材料叶片的叶绿素含量变化幅度不大。在14 ： 00时，叶绿素值整体较其它时间点偏低，说明高温胁迫下大叶千斤拔叶片中叶绿素含量降低。因此根据叶面温度和叶绿素值确定以下试验选择的时间点为14 ： 00。

2.2 高温胁迫对大叶千斤拔外部形态指标的影响

2.2.1 高温胁迫对大叶千斤拔叶片厚度的影响

叶片的厚度受到环境因素的影响，如水分、温度、氧气、空气湿度等都在一定程度上对叶片的厚度有影响[25-26]。从图3可以看出，在高温胁迫下，15份大叶千斤拔材料的叶片平均厚度为0.348 mm，厚度最小的材料为F12，厚度只有0.256 mm，较大的有材料F1、F2、F3、F4和F5，最大厚度达到0.421 mm，是前者的1.64倍，总体变异系数达到8.45%，表明不同材料间的叶厚度差异显著。较厚的叶片有利于减弱蒸腾作用，减少水分散失。

2.2.2 高温胁迫对大叶千斤拔叶片大小的影响

叶片是制造有机物的主要场所，植物产量的高低，在一定范围内与叶面积的大小呈正相关[27]。叶面积在一定程度上反映了植物的生长速度，有较大的叶面积及高效的物质运转，才能促进根的生长。在热胁迫下叶面积越大，光合生长势越强，相应的抗热能力增强[28]。从图4可以看出，在高温胁迫下，15份大叶千斤拔材料的叶长和叶宽差异不明显，叶面积差异显著。15份材料的叶面积平均值为20.464 cm2，叶面积最小的材料为F12，为14.698 cm2，叶面积较大的材料有F1、F3和F5，其中最大叶面积达到24.756 cm2以上，是前者的1.68倍。

2.3 高温胁迫对大叶千斤拔叶片生理指标的影响

2.3.1 高温胁迫对大叶千斤拔叶片含水量的影响

植物几乎所有的代谢过程都有水的参与，水分条件影响着植物形态、生理生化代谢及地理分布范围[29]，相对含水量的多少是植物遭受热胁迫时最直接的表现，含水量越大，表明植物越不受高温的胁迫[30]。从图5可以看出，在高温胁迫下，15份大叶千斤拔材料的叶片含水量差异较大，其中F14和F15的含水量均大于69%，显著大于其他材料；F12和F13的含水量最小。材料F14的叶片含水量是F13的1.15倍。

2.3.2 高温胁迫对大叶千斤拔叶片细胞膜透性的影响

植物在高温胁迫下，会引起植物细胞膜不同程度的损伤，导致细胞内电解质外渗，外渗液的电导率值越大，表明细胞膜透性变化越大，植物受到的伤害也就越大，其耐热性就越弱[31]。从图6可看出，高温胁迫下，不同参试材料的细胞膜相对电导率差异显著，平均相对电导率为57.74%，材料F9、F11、F12的相对电导率较高，大于70%；材料F3、F14、F15的相对电导率较低，分别为38.7%、44.3%和43.7%，说明这些材料的细胞膜破坏程度较小，对高温的耐受性较强。

2.3.3 高温胁迫对大叶千斤拔叶片MDA含量的影响

丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，MDA含量越高，细胞膜脂过氧化水平越高，细胞膜受损越大，其耐热性也就越差，反之则耐热性越好[32]。从图7可以看出，高温胁迫下，不同参试材料的丙二醛含量差异显著，丙二醛平均含量为2.693 μmol/L，参试材料F1、F3和F13的丙二醛含量较高，高于平均值30%，大于3.5 μmol/L；材料F11、F12、F15的丙二醛含量较低，材料F14的丙二醛含量最低，低于平均值32%，显著低于其他大叶千斤拔材料，说明材料F14的抗氧化能力较强，对高温的抵抗力较强。

2.4 隶属函数综合分析

通过表2隶属函数分析可将参试材料大致分为3个耐热级别：1级（相对耐热：0.6～1），2级（中等耐热：0.3～0.6），3级（相对敏感：0～0.3）。15份大叶千斤拔材料中相对耐热的材料有F3、F5、F14、F15，中等耐热材料有F1、F2、F4、F6、F7、F8、F9、F10和F11，对热相对敏感的材料有F12和F13。

3 讨论

高温使植物外部形态、组织和结构发生变化，冉茂林等[33]研究3个萝卜不同耐热品种在高温胁迫下的生长表现，发现热胁迫对萝卜生长的影响主要表现在叶面积下降、个体变小等方面，通过苗期单位面积、叶鲜重可预测萝卜耐热性。刘春风等[34]研究高温胁迫下8个海棠品种的苗木形态和生长情况。结果表明：耐热性强的品种始终保持较快的苗高和地茎生长速率，耐热性差的品种苗高、地茎的生长速率缓慢。本试验的研究结果与之一致，材料F3和F5的叶片厚度和叶面积均较大，通过隶属函数分析耐热级别为1级。F12的叶片厚度和叶面积最小，耐热级别为3级，不耐热。

高温是引起植物萎蔫、叶片含水量下降的主要原因。维持较高的含水量，被认为是具有较好耐热性的表现之一。孙彦等[35]研究发现高温下5种草坪草叶片相对含水量下降，高羊茅的叶片相对含水量显著高于其他4种草坪草，为相对耐热草种。本试验的研究结果与之相一致，F14和F15的含水量最大，通过隶属函数分析耐热级别为1级。F12和F13的含水量最小，耐热级别为3级，不耐热。

高温胁迫下，细胞原生质膜的结构和功能首先受到伤害，细胞内电解质外渗液的电导率值越大，表示电解质的渗漏量越多，细胞膜受害程度越重[36]。陆銮眉等[37]以龙船花和细叶龙船花为材料，在高温处理下，2种龙船花叶片均受到不同程度伤害，相对电导率含量随温度的升高而增加。刘凯歌等[38]对2种耐热性不同的甜椒品种进行高温胁迫研究，结果显示：2个品种的相对电导率在高温处理期间呈逐渐升高趋势，并且热敏品种始终高于耐热品种。本试验的研究结果与之一致，F3、F14和F15材料的相对电导率较低，通过隶属函数分析耐热级别为1级。材料F12的相对电导率最高，耐热级别为3级，不耐热。

当受到高温胁迫时，膜系统遭到破坏，MDA积累量越大，说明细胞受损程度越大。刘大林等[39]通过对16个紫花苜蓿品种进行耐热筛选，研究表明，在夏季高温胁迫下，不同紫花苜蓿品种与正常生长状态下的相比，MDA含量均显著增加。黄闽敏等[40]在高温胁迫对春兰进行试验，结果表明，高温使丙二醛含量增加。何铁光等[41]研究了高温胁迫下辣椒丙二醛含量的变化。结果表明：高温胁迫后，不同耐热性材料的丙二醛含量增加，热敏材料增幅高于耐热材料。与本试验的研究结果一致，F14和F15材料的MDA含量较低，通过隶属函数分析耐热级别为1级。材料F13的MDA含量较高，耐热级别为3级，不耐热。

本试验在田间自然高温环境下进行，更符合实际生产需要，但是由于其鉴定方法耗时费力，并因实际的高温环境较为复杂，使得鉴定结果重复性较差。下一步将结合人工控制的环境下模拟高温胁迫再进行耐热鉴定与筛选。

4 结论

本文以自然高温处理后的大叶千斤拔种质为材料，研究高温胁迫对叶片厚度、叶面积、叶绿素值、叶片含水量、MDA含量、叶片质膜透性等外观和生理指标的影响，筛选出耐热性不同的材料，为大叶千斤拔耐热性鉴定、评价及耐热品种的选育提供理论依据。综合结果表明，形态指标和生理指标相结合对大叶千斤拔的耐热品种选育途径更准确，更可靠。

本试验结果表明，参试材料F3和F5的植物生长表现较好，F14和F15在生理指标测定中的综合表现较好，因此，从高温胁迫对不同大叶千斤拔的生理指标影响来看，F14和F15相比其它13个材料具有较好的耐高温特性。

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