两种化学发光法测定乙肝五项性能评估

王　军，刘妮妮，赵　权，叶琳琳，刘　婧，刘玉琳，徐　菲

两种化学发光法测定乙肝五项性能评估

王军，刘妮妮，赵权，叶琳琳，刘婧，刘玉琳，徐菲

［关键词］光激化学发光法；乙型肝炎；定量分析

光激化学发光法（light initiated chemiluminescence assay，LICA）是以纳米级高分子微粒为载体的免疫化学发光技术，本研究对该方法与化学发光微粒免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）检测乙型肝炎病毒（HBV）感染的血清学标志物的结果做比较，以分析该方法检测性能与CMIA的符合程度及对临床诊断的影响。

1　材料和方法

1.1仪器、试剂及检测样本收集1015例疑似HBV感染者静脉血，分离血清待测；收集乙肝五项同时为阴性（经CMIA筛查）的一个血清盘。光激化学发光法的仪器（LiCA HT高通量免疫分析仪和LiCA SP全自动移液器）和试剂，均为上海博阳生物科技有限公司产品；化学发光微粒免疫分析法的仪器（ARCHITECT i2000SR）和试剂，均为美国雅培公司产品；相关试剂批号如下：

雅培试剂批号：HBsAg（26057LF00）；HBsAb （27235LF00）；HBeAg（24065LI00）；HBeAb（24512L I00）；HBcAb（22362LI00）。

博阳试剂批号：HBsAg（A1019）；HBsAb（A1020）；HBeAg（A1021）；HBeAb（A1021）；HBcAb（A1021）。

1.2结果判断标准（1）雅培结果判断标准：HBsAg＞0.05 IU/mL；HBsAb＞10 mIU/mL；HBeAg＞1 S/CO；HBeAb＜1 S/CO；HBcAb＞1 S/CO。（2）博阳结果判断标准：HBsAg＞0.2 ng/ml；HBsAb＞10 mIU/ml；HBeAg＞1 PEIU/ml；HBeAb＞2 PEIU/ml；HBcAb＞5.3 PEIU/ml。

1.3评价方法

1.3.1精密度根据EP5-A文件中关于实验方案的要求，应对标本每天做2批实验，批间相隔的时间不少于2 h，每批对样品进行双份测定，20 d后得到80个结果，共40对。每次检测前，分别取出HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的阴性血清盘、低值质控品QL和高值质控品QH，室温放置30 min后再上机检测。按EP5-A文件的要求对检测结果进行统计分析，计算CV值。

1.3.2回收率测定分别取上海博阳生物科技有限公司提供的HBsAg、HBsAb 6点定标液各200 μl，按浓度梯度分别加入5个试管中，0浓度管为空白，不加定标液；随机取一份HBsAg阳性血清和HBsAb阳性血清，通过光激化学发光法分别测其浓度，然后将两份血清各200 μl分别加入已知浓度的试管中，每管重复测量2次，取其均值，以各浓度点的实测平均值占其理论期望值的百分数计算其回收率。

1.3.3检测结果比较通过两种方法对1015例HBV感染者临床样本的平行检测，以雅培CMIA为参考对象来评估博阳LICA方法检测的乙型肝炎病毒5项血清学指标与CMIA检测结果的符合率。

1.4统计学方法采用SPSS 16.0统计软件，曲线拟合采用3次样条曲线拟合，对两种方法检测结果差异的显著性比较采用配对χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1工作曲线对不同检测项，取同一批号不同靶值的定标品连续检测5 d，2次/d。曲线拟合采用3次样条曲线拟合，根据各自的均值绘制工作曲线，r2＝0.998。

2.2试验性能评价

2.2.1精密度检测LICA五项血清学标志精密度结果见表1、2。

表1　LICA乙肝五项低值质控品精密度

表2　LICA乙肝五项高值质控品精密度

2.2.2回收率测定不同浓度HBsAg、HBsAb的回收率见表3、4，HBsAg平均回收率为100.16% （96.81%～102.69%）；HBsAb平均回收率为99.7% （95.85%～104.55%）。

表3　不同浓度的HBsAg回收率

表4　不同浓度的HBsAb回收率

2.2.3两种方法检测结果比较见表5。

表5　LICA与CMIA检测HBV感染5项血清学标志结果比较

3　讨　论

LICA检测原理源于90年代问世的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术［2-4］，该技术采用了纳米级颗粒，大大增加了生物分子的包被面积，同时借助链霉亲和素-生物素放大系统，使单位体积反应体系中含有更高浓度的生物分子，为实现超高敏感性，减少样本和试剂用量奠定了基础。另外，这种纳米颗粒在液相中保持稳定的悬浮状态，并借助于结合则发光原理，实现了均相免清洗检测，和其他化学发光法相比具有如下特点：（1）LICA反应体系为均相反应，传统免疫检测技术多为非均相反应，非均相反应具有反应不充分、反应时间长、反应体系温度均一性差的缺点，而LICA整个反应是在均相中进行的，均相具有反应充分、反应时间短、反应体系温度均一性好的优点，显示出该方法具有很高的精密度；（2）LICA另一个特点是免清洗，由于在均相中反应，加上其独特的检测原理结合则发光，所以检测过程无须进行清洗分离，则能有效降低检测过程中的随机误差和交叉污染，最大限度地提高了检测的准确度；（3）LICA样本及试剂用量微量化，每项样本及试剂用量仅25 μL，随着样本用量地大幅减少，使得检测小型化芯片化和高通量成为可能；（4）LICA超敏感性，由于采用了纳米级微粒，增加了反应表面积，缩短了反应时间，使检测的敏感性大大提高。有文献报道，该方法对可能存在的干扰物质，如单线态氧淬灭物质（抗氧化剂、血红蛋白、维生素C等）生物素结构类似物如总胆红素、三酰甘油等具有较好的耐受能力，少数物质在较高的浓度时的确存在干扰，但在常规浓度情况下，这些干扰作用可以忽略不计，表现出较高的特异性［5-7］以CMIA为参照，LICA对1015例临床样本检测结果显示，2种检测方法对检测结果的符合率分别为99.9%、99.7%、99.8%、99.51%、99.7%，具有很高的一致性，而作为辅助指标的抗HBe和HBeAg存在一定差异，其中两者不符的样本多处于灰区弱阳或弱阴范围，导致差异的原因是由于2种方法在抗HBe和HBeAg的原材料和溯源选择上存在一定差异［8］；当2种方法检测结果发生分歧时，可寻求第三方验证，本次试验，由于样本剩余量不足，未能将所有与CMIA不符的结果进行第三方验证。总体上，LICA与CMIA在HBV感染的血清学标志项目上符合率很高，而在个别项目上存在一定的差异，但这并不影响本评价试验得出的结论。总之，LICA以其独特的检测技术实现了微量敏感快速均相免清洗检测，与CMIA相比，具有相近的检测性能。

参考文献

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［8］邱春嫦，劳小斌.电化学发光免疫法定量检测乙肝病毒的临床应用［J］.中国热带医学，2005，5（4）：678-679.

［2015-08-18收稿，2015-09-16修回］［本文编辑：吴蓉］

［中图分类号］R512.62

［文献标志码］B

［作者单位］266071山东青岛，解放军401医院检验科（王军，刘妮妮，赵权，叶琳琳，刘婧，刘玉琳，徐菲）

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.02.010