琼玉膏延缓衰老作用的候选靶蛋白分析

曲卫玲　曹媛　刘焕兰　童玲　范睿　刘荣福

[摘要]采用iTRAQ技术研究琼玉膏干预衰老大鼠模型的下丘脑蛋白，寻找候选靶蛋白，探索琼玉膏延缓衰老的作用机制。结果表明，琼玉膏可以提高大鼠血清GSHPx及肝脏SOD活力。iTRAQ技术鉴定到的总蛋白为3 522个，FDR<1%。通过数据分析，鉴定出琼玉膏组与模型组比较，具有295种差异蛋白；模型组与空白组比较，具有20种差异蛋白；其中与空白组相比，模型组中下调而琼玉膏组中上调的蛋白有14种。在琼玉膏组和模型组的295种差异蛋白中，差异倍数≥130的差异蛋白有40种，最高为147。查阅文献及基因功能检索，筛选出琼玉膏延缓衰老的候选靶蛋白12种：ST18，Ptprc，PSMB8，INPP4B，Shc3，Pik3r1，PIP5K1C，Nampt，Rasgrp2，Asah2，Pdpk1，Map2k7。Western blot法检测下丘脑炎症通路NFκB蛋白，模型组（096）相对空白组（085）表达量升高；而琼玉膏组（089）相对模型组则下降。QPCR检测PIP5K1C，Ptprc等与炎症相关的候选靶蛋白，与空白组相比，模型组中mRNA相对表达量显著下降（P<001），而琼玉膏组中则显著升高（P<001），与蛋白质组学数据分析一致。琼玉膏可能通过调节下丘脑炎性反应而延缓衰老的发生。

[关键词]琼玉膏；延缓衰老；候选靶蛋白；下丘脑；iTRAQ；NFκB

[Abstract]To explore the associated proteins of the hypothalamus in aging rat models with intervention by Qiongyugao（QYG） based on iTRAQ technology， find out the target protein candidates and investigate the mechanism of delaying aging for Qiongyugao The results showed that Qiongyugao increased GSHPx activity in serum and SOD activity in liver； the total protein count identified by iTRAQ was 3 522， FDR<1% There were 20 kinds of differential proteins between the blank group and model group； there were 295 kinds of differential proteins between model group and QYG group， and 40 kinds of them had a difference multiple ≥130 （the maximum value was 147） Compared with blank group， there were 14 kinds of proteins that were downregulated in model group and upregulated in QYG group Combined with literature search and gene function search， 12 kinds of target protein candidates were screened out ： ST18， Ptprc， PSMB8， INPP4B， Shc3， Pik3r1， PIP5K1C， Nampt， Rasgrp2， Asah2， Pdpk1， and Map2k7 The expression of nuclear factorkappa B （NFκB） in the hypothalamic inflammatory pathway was detected by Western blot and the results showed that its expression level in model group（096） was higher than that in control group（085）， while its expression level in QYG group（089） was lower than that in model group QPCR results showed that the relative mRNA expression levels of PIP5K1C and Ptprc in model group were significantly lower than those in blank group（P<001）； while compared with the model group， the mRNA expression levels of PIP5K1C and Ptprc in QYG group were significantly increased（P<001） This result was consistent with proteomics data QYG may delay aging by regulating hypothalamic inflammatory reaction

[Key words]Qiongyugao（QYG）； antiaging； target protein candidates； hypothalamus； iTRAQ； NFκB

doi：10.4268/cjcmm20160724

琼玉膏作为一剂经典养生方，曾被清宫皇帝作为日用养生品服用；现今应用琼玉膏治疗虚劳、癌症的效果也得到认可。琼玉膏组方简单，仅生地、人参、茯苓和蜂蜜4味，但配伍精良，补阴而不忘扶阳、益气而不忘育阴，既可治病也可养生，有良好的改善免疫、延缓衰老的作用。但是目前关于琼玉膏的作用机制少有研究，本课题研究希望能有助于阐明琼玉膏延缓衰老机制，有利于琼玉膏的研发和应用。

1材料

雄性SD大鼠，42只，日龄180～200 d，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（粤）20130034。

自制琼玉膏（蜂蜜，北京同仁堂有限公司；生地黄，产地河南，北京冠城药业有限公司；人参，产地吉林，北京同仁堂有限公司；茯苓，产地云南，广东众康中药饮片有限公司）； D半乳糖（美国Amresco公司）；尿素（美国GibcoBRL公司，01M00491V）；二硫素糖醇（美国Promega公司，R21041092）；碘乙酰胺IAA（美国Promega公司，NI174659）；测序级胰蛋白酶Trypsin（美国Promega公司，0000142423）；SDS（美国Sigma公司，L5750）；三氟乙酸TFA（美国Sigma公司，A0329207）；TMT 6标试剂盒（美国Thermo Scientific公司，PL208420）；蛋白酶抑制剂（瑞士Roche公司，10061200）；三乙基碳酸氢铵TEAB（巴拉圭圣克鲁斯公司，NH174658）；高纯总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）（RP1201），Recombinant DNase I （RNasefree）（2270A），Recombinant Ribonuclease Inhibitor（2313A），Oligo d（T）18 Primer（3806），Random Primer [Hexadeoxyribonucleotide mixture；pd（N）6]（3801），Reverse Transcriptase MMLV（RNase H）（2641A），dNTP Mixture（T4019）均来自日本takara公司；SYBR GREEN（日本ToYoBo公司，QPK201）；PMSF（100 mmol，碧云天生物技术，ST506）；RIPA裂解液（碧云天生物技术，P0013B）；pageruler prestained protein ladde（美国赛默飞公司，26619）；βACTIN抗体肌动蛋白（BM0627）；羊抗兔IgG HRP（BA1054）均来自博士德公司；丙烯酰胺Acrylamide（0341），N，N亚甲基甲叉双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide，110269），Tris Base（0497），SDS（L5750），过硫酸铵（ammonium peroxodisulfate，0488），甘氨酸（glycine，0167），聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（吐温20，Tween20，0777）均来自美国Amresco公司。

冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；HClass超高压液相色谱和NanoAcuity超高压纳升级液相色谱（Waters公司）；Q Exative质谱仪（Thermo Scientific公司）；UMAX Powerlook 2100XLUSB扫描仪；IKA振荡器；恒温加热块（鼎国昌盛生物技术有限公司）；冷冻台式离心机（eppendorf centrifuge 5417R型）；LX100手掌式离心机（其林贝尔仪器）；电热恒温水浴锅（长安科学仪器）；A100PCR仪（Long Gene）；GelDoc XR凝胶成像系统（BioRAD）；JY200C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；7S2脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；5200凝胶成像系统（Tanon）。

2方法

21动物分组及造模方法

6～7月龄健康雄性SD大鼠，按随机数字表法分为3组：空白对照组、衰老模型组和琼玉膏给药组，每组14只。除空白组外，其余2组每天腹腔注射D半乳糖300 mg·kg-1，连续造模6周，空白对照组腹腔注射等剂量生理盐水。同时，琼玉膏给药组每天灌胃琼玉膏0005 83 mL·g-1，衰老模型组和空白对照组灌胃等剂量生理盐水。给药结束后，腹主动脉取血（3组各取到9例），取肝脏组织（模型组取到7例，其余2组9例），进行抗氧化活性测试。

22同位素相对标记与绝对定量（iTRAQ）

3组实验动物取下丘脑，每组2个生物学重复，共计6个样本，进行12标iTRAQ蛋白组检测分析：①提取蛋白质并定量；②蛋白质酶解；③肽段标记；④标记肽段除盐；⑤高pH反向液相色谱对标记肽段进行分离；⑥对标记肽段进行质谱检测；⑦基于质谱的定性定量分析。

23QPCR验证

检测BLAB/c nu/nu下丘脑对差异蛋白表达量的关系，每组4个样本重复：①引物设计；②总RNA的提取与检测；③逆转录（RT）；④QPCR反应体系；⑤跑胶验证。

24Western blot验证

检测BLAB/c nu/nu下丘脑差异蛋白的表达情况，每组3个样本重复：①蛋白提取与含量测定；②电泳；③转膜；④封闭、孵育；⑤显影；⑥灰度检测。

25统计学处理方法

采用SPSS 190统计软件，数据均以±s表示，用单因素方差分析，t检验等进行组间比较。

3结果

31衰老模型评价

大鼠出现毛色枯槁无光、皮肤弹性差、精神萎靡、倦怠嗜睡、明显减少进食、形体瘦弱、行动迟缓等衰老体征；取血清和肝脏组织进行抗氧化能力测试。

311血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）检测与空白组比较，模型组大鼠血清GSHPx活力值明显下降，而琼玉膏组可以提升其活力值（但未及空白组水平），具有统计学意义，见表1。

因此，从模型组的动物形态学观察及血清GSHPx，肝脏SOD活力均呈下降趋势来看，衰老模型造模成功，且初步判断琼玉膏具有抗氧化性。

32差异表达蛋白

比较空白组、琼玉膏组和模型组中下丘脑蛋白质含量，2组样本中各个蛋白表达量的比值，大于12或者小于083就认为是差异蛋白，采用分组t检验，P<005为有统计学意义。鉴定出琼玉膏组与模型组比较，具有295种差异蛋白；琼玉膏组与空白组比较，具有96种差异蛋白；模型组与空白组比较，具有20种差异蛋白。

与空白组相比，在模型组中下降而琼玉膏组可以上调的差异蛋白共有14个：细胞色素c氧化酶多肽VIc2（Cox6c2），中性神经酰胺酶（Asah2），植烷酸辅酶A 羟化酶相互作用类蛋白（Phyhipl），尼克酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt），尾锚定蛋白插入受体WRB（Wrb ），O甘露糖β1，4N乙酰葡糖胺基转移酶（Pomgnt2），信号转导子和转录激活子（Stat5b），脂酰CoA合成酶（Aacs），特定微管伴侣蛋白E（Tbce），3磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1（Pdpk1），双特异性作用蛋白激酶7（Map2k7），RAS脒基释放蛋白2（Rasgrp2），SHC转运蛋白（Shc3），细胞周期素G蛋白（Gak）。

对琼玉膏组与模型组相比的295种差异蛋白中进一步筛选，差异倍数≥130的差异蛋白有40种（最高为147）。

结合文献及基因功能检索，对上述结果进行分析，筛选出与衰老可能相关的差异蛋白，见表3。

33WB检测

运用WB法检测衰老相关通路NFκB蛋白表达量情况，光密度测定结果见表4，图1，2。与空白组比较，模型组NFκB通路被激活，蛋白表达量升高；与模型组比较，琼玉膏组NFκB蛋白的表达量降低。

34QPCR检测

QPCR检测BLAB/c nu/nu下丘脑PIP5K1C，Ptprc mRNA表达量，见图3。从电泳图可以看出提取的RNA含量合格，没有被污染。

通过计算结果显示，运用琼玉膏后PIP5K1C，Ptprc mRNA相对表达量有差异。经两样本t检验，与空白组相比，模型组中PIP5K1C mRNA相对表达量显著下降（P<001），而琼玉膏组中PIP5K1C mRNA相对表达量显著升高（P<001）；同样，与空白组相比，模型组中Ptprc mRNA相对表达量显著下降（P<001），而琼玉膏组中Ptprc mRNA相对表达量升高（P<001），见表5，图4。通过凝胶电泳验证，PCR引物设计方案设计出结果与实际实验结果一致。

4讨论

衰老原因非常复杂，涉及面广，有关衰老的学

41琼玉膏对D半乳糖致衰大鼠的抗氧化能力

机体对自由基的清除能力是目前运用较多的评价衰老的指标。本课题对实验大鼠抗氧化能力研究表明，琼玉膏可以提高大鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）及肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活力，从而提升总抗氧化能力，清除自由基，延缓衰老。

42琼玉膏延缓衰老的候选靶蛋白筛选

综合比较空白组、模型组和琼玉膏组的下丘脑蛋白，结合查阅相关研究文献及基因功能，进一步筛选出12种与衰老相关的差异蛋白：肿瘤抑制蛋白18（ST18）、酪氨酸激酶C型受体（Ptprc）、低相对分子质量蛋白7抗体（PSMB8）、Ⅱ型多磷酸肌醇4磷酸酶（INPP4B）、SHC转运蛋白（Shc3）、磷酸化磷脂酰肌醇激酶（Pik3r1）、磷脂酰肌醇4磷酸5激酶（PIP5K1C）、尼克酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）、RAS脒基释放蛋白2（Rasgrp2）、中性神经酰胺酶（Asah2）、3磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1（Pdpk1）、双特异性作用蛋白激酶7（Map2k7）。这些差异蛋白与代谢、细胞生长分化、信号转导等有关，多参与影响细胞凋亡与细胞周期、炎症反应、肿瘤发生等通路[25]，与衰老相关。

43琼玉膏延缓衰老的炎症通路机制

通过QPCR验证筛选差异蛋白中的PIP5K1C，Ptprc发现，与空白组相比，2个差异蛋白均在模型组中下调，而在琼玉膏组中又有上调趋势，这与蛋白质组学数据分析结果一致。PIP5K1是细胞内产生磷脂肌醇PIP2的重要蛋白，参与多种细胞生物学功能，研究人员发现该蛋白在中性粒细胞迁移中起重要作用：缺失PIP5K1C的中性粒细胞穿过血管壁到达炎症部位的能力明显下降[6]。Ptprc是类风湿性关节炎的遗传生物标志[7]。有研究资料表明，ST18，Nampt等也能够调节免疫功能及促进炎症反应[89]。半乳糖诱导PIP5K1C，Ptprc等蛋白表达异常，引起机体氧化应激及炎症反应，促进炎症通路NFκB发生改变。NFκB是机体防御反应、组织损伤和应激的相关通路，是机体内炎症激活的标志。近年有研究表明，下丘脑NFκB通路炎症是导致衰老的重要原因[10]。而琼玉膏可以纠正差异蛋白异常表达量，调节NFκB通路。

因此，课题组将在此研究基础上，进一步对其他候选靶蛋白进行筛选，并通过动物实验及细胞水平实验研究琼玉膏改变下丘脑炎性衰老的具体机制。

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[责任编辑曹阳阳]