新型钌配合物通过内源性线粒体凋亡通路诱导Bel-7402细胞凋亡的机制

王金全，薄华本，陈启助

(广东药科大学 广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东 广州 510006)



新型钌配合物通过内源性线粒体凋亡通路诱导Bel-7402细胞凋亡的机制

王金全，薄华本，陈启助

(广东药科大学 广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东 广州 510006)

摘要:目的 研究钌配合物Ru-HMIP对肝癌细胞Bel-7402的抑制作用及其机制。方法 MTT法检测Ru-HMIP对Bel-7402细胞的杀伤作用；流式细胞术检测其诱导细胞凋亡情况；JC-1荧光探针检测线粒体膜电位；DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)；Western blot检测细胞凋亡相关蛋白。结果 Ru-HMIP对Bel-7402细胞有较强的杀伤效果；其对细胞毒性作用是通过诱导细胞凋亡方式；Ru-HMIP在Bel-7402细胞中产生过量ROS，并且这种作用及其细胞毒性都可被还原剂乙酰半胱氨酸(NAC)所阻断。Ru-HMIP可以破坏Bel-7402细胞线粒体膜电位；上调Bax，下调Bcl-2，同时激活Caspase-9及Caspase-3。结论 Ru-HMIP可以在体外有效抑制Bel-7402细胞增殖，其作用机制是在细胞内诱发过量ROS，继而通过内源性线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。

关键词:钌配合物； Bel-7402细胞； ROS； 凋亡通路

肝癌是临床最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，每年全世界新增约63万例肝癌患者[1]。目前肝癌的治疗效果并不理想，且病死率高，所以亟需研发新的治疗药物。近些年，基于金属钌的配合物由于具有更强的抗肿瘤活性和较低的系统毒性，成为最有可能应用于临床的新一代金属抗肿瘤药物[2]。至今已经有3种金属钌抗肿瘤药物NAMI-A、KP1019和NKP1339进入了临床研究阶段，并且得到了较好的研究结果[3]。钌配合物的抗肿瘤作用机制呈现多靶点和多机制的特点，其中包括抑制DNA拓扑异构酶，产生活性氧(ROS)，蛋白激酶抑制，通过稳定G-四链体DNA而抑制端粒酶活性等[4- 5]。本课题组前期设计合成并筛选出一系列具有高活性、相对低毒性的手性钌多吡啶配合物，它们对多种癌细胞表现出良好的杀伤活性，并且对正常肝细胞L02表现较低的毒性，有可能成为新型的选择性化疗候选药物[6]。为了探明其抗瘤谱及研究相关作用机制，本次研究选取活性较好的钌配合物Ru-HMIP为研究对象，以人肝癌细胞Bel-7402为研究模型，探讨Ru-HMIP对Bel-7402的抗肿瘤效果及相关作用机制，以期为肝癌的治疗及Ru-HMIP的进一步研究和开发提供参考。

1材料与方法

1.1主要材料、试剂及仪器

Ru-HMIP合成方法参照本课题组已发表文献[6]，用DMSO配制成20 mmol/L储备液，4 ℃存放备用。DMEM细胞培养基、胎牛血清(Hyclone公司)；MTT、Annexin V-FITC/PI试剂盒、JC-1试剂盒、DCFH-DA(Invitrogen公司)；Western blot 抗体(Abcam公司)；其他常用生化试剂如PBS及蛋白提取试剂盒及测定试剂(碧云天生物科技公司)；550型酶标仪(Bio-rad，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf centrifuge 5430，美国)；倒置荧光显微镜(Zeiss Axio D1，德国)；FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences，美国)；Western blot小型电泳系统(Bio-rad mini，美国)。

1.2肿瘤细胞培养

肝癌细胞株Bel-7402为本实验室保存。细胞置于37 ℃，5%(φ)CO2饱和湿度的培养箱中，在含有10%(φ)新生胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基中培养和传代。如无特殊说明，实验所用细胞均处于对数生长期。

1.3噻唑蓝比色法(MTT法)检测Ru-HMIP对Bel-7402细胞杀伤活性

实验细胞置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中生长至对数期，0.25%胰酶消化收集细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞密度大约在1×104/mL，每孔100 μL接种于96孔板，置于培养箱中培养24 h。换液，加入不同浓度的Ru-HMIP，每个浓度做3个平行样，设置空白调零组(培养基、MTT、DMSO)，空白组(培养基、细胞、相同浓度的药物溶解介质、MTT、DMSO)，继续孵育24 h。吸去上清，每孔加入90 μL新鲜培养液，再加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，培养4 h。终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上低速振荡30 min，使结晶物充分溶解，酶标仪检测490 nm波长各孔的A值。相关的细胞增殖的抑制率及半数抑制浓度(IC50)用下面的公式进行计算：生长抑制率=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)，所有A值均减去空白调零组A值。将抑制率与药物浓度作图，得出剂量反应曲线，计算IC50值。

1.4Annexin V-FITC/PI双染检测Ru-HMIP诱导Bel-7402细胞凋亡

收集Bel-7402细胞，调整细胞悬液浓度，6孔板中每孔接种约2×105个细胞，置于培养箱中培养约24 h。换液，加入不同浓度Ru-HMIP，孵育24 h。小心吸去上清，0.25%胰酶消化收集细胞，1 000 r/min，离心5 min，去上清，加入100 μL PBS重悬，用滤网过滤。1 000 r/min，离心5 min，去上清，加入100 μL 1× Binding Buffer重悬细胞，分别加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI，室温孵育15 min，加入400 μL 1× Binding Buffer，用FACSCanto II流式细胞仪上机检测。

1.5细胞内ROS检测

收集Bel-7402细胞，调整细胞悬液浓度，6孔板中每孔接种约2×105个细胞，置于培养箱中培养约24 h。换液，加入不同浓度的Ru-HMIP及H2O2，孵育12 h。吸去上清，0.25%胰酶消化收集细胞，然后各孔加入10 μmol/L DCFH-DA荧光探针，37 ℃孵育30 min。离心去上清，PBS重悬，用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪检测分析，激发波长488 nm。为观察ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对Ru-HMIP诱发ROS或者细胞毒性的影响，另外设NAL干预组，在加入Ru-HMIP或者H2O2前1 h加入浓度为10 mol/L的NAC，孵育相应时间，流式细胞术检测ROS，MTT法检测细胞毒性。

1.6JC-1荧光染色检测Ru-HMIP对Bel-7402线粒体膜电位影响

收集Bel-7402细胞，调整细胞悬液浓度，将细胞接种于6孔板，每孔2 mL，每孔接种约2×105个细胞。置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养12 h。换液，加入不同浓度Ru-HMIP，每一个浓度设3个平行孔，同时设置加入相同浓度药物溶解介质的空白对照孔，继续培养12 h。吸出上清，PBS洗涤2次，加入500 μL JC-1工作液，37 ℃，室温暗处孵育15 min，吸出工作液，PBS洗涤2次，荧光倒置显微镜下观察拍照。

1.7蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测细胞凋亡信号通路

蛋白样品制备，收集Bel-7402细胞，调整细胞悬液浓度，6孔板中每孔接种约2×105个细胞，置于培养箱中过夜。换液，加入不同浓度Ru-HMIP孵育24 h，收集细胞，按试剂盒步骤提取蛋白(其中细胞色素C的分析提取是细胞质蛋白，其他蛋白分析提取的为总细胞蛋白)。测量提取蛋白浓度，将各组蛋白浓度用提取液调至相同。取适量的蛋白样品，加入上样缓冲液稀释，100 ℃加热5 min使蛋白变性，20 000 r/min离心，取上清待用。SDS-PAGE电泳，转到PVDF膜，转膜结束后取出膜用TBST冲洗一遍，浸没于封闭液封闭1 h。把膜从封闭液里取出，用TBST冲洗一遍后，浸没于一抗里，置于4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次6 min。加入相应二抗室温摇床孵育1 h。二抗孵育结束后，用TBST洗膜3遍，每次5 min。然后将ECL均匀滴加到PVDF膜，覆盖上保鲜膜，置于曝光盒内后曝光显影。根据目的蛋白信号强弱选择曝光时间以获得最佳效果，扫描胶片，保存分析结果。

2结果

2.1Ru-HMIP对Bel-7402细胞的抑制作用

体外实验显示(表1)，不同实验浓度的Ru-HMIP均能够有效杀伤Bel-7402肝癌细胞，且随着剂量的增大抑制率增高，存在剂量-效应关系，其半数抑制浓度为6.98 μmol/L，95%可信区间为5.97～8.17 μmol/L。

2.2Ru-HMIP对Bel-7402细胞凋亡的影响

剂量为5 μmol/L的Ru-HMIP作用Bel-7402细胞24 h后，检测到9.4%的细胞发生早期凋亡，11.6%发生晚期凋亡；作用浓度为10 μmol/L时，34.3%的细胞处于早期凋亡状态，19.7%的细胞处于晚期凋亡状态。当作用浓度提高到20 μmol/L时，共有71%的细胞处于凋亡状态(图1)。

表1Ru-HMIP作用24 h 后对Bel-7402细胞增殖的影响

Table 1Effect of Ru-HMIP on Bel-7402 cell proliferation

组别剂量/(μmol·L-1)抑制率/%IC50/(μmol·L-1)对照组-00.1%DMSO-2.21±0.65Ru-HIMP2.520.56±3.466.98545.23±4.661056.34±4.6595%可信区间=2082.38±5.47(5.97～8.17)4092.13±6.65

2.3Ru-HMIP对Bel-7402细胞内ROS水平及其对细胞毒性的影响

Ru-HMIP作用于Bel-7402细胞12 h后，可以产生剂量依赖的ROS，其水平与阳性对照H2O2相当。同时，NAC可以完全抑制Ru-HMIP或者H2O2在Bel-7402细胞中诱发的ROS(图 2A)。进一步研究了Ru-HMIP产生的ROS与其细胞毒性的相关性，结果显示，在将Bel-7402细胞预先用NAC处理之后，可以明显降低H2O2或者Ru-HMIP对Bel-7402产生的细胞毒性(图 2B)。

2.4Ru-HMIP对Bel-7402细胞线粒体膜电位影响

荧光倒置显微镜检测细胞线粒体膜电位结果显示(图3)，Ru-HMIP作用Bel-7402细胞12 h后，由于其线粒体去极化导致线粒体膜电位的下降，JC-1在线粒体基质中形成的聚集体减少，导致在给药组细胞内的绿色荧光增强，相对于对照组的荧光曲线截面发生偏移。随着Ru-HMIP浓度的增加，细胞内绿色荧光强度逐渐增加，说明Ru-HMIP的确引起了Bel-7402细胞线粒体膜电位的下降。

2.5Ru-HMIP对Bel-7402细胞凋亡通路的影响

Ru-HMIP作用于Bel-7402细胞24 h后，细胞中非活化的Caspase-9含量降低，而活化型Caspase-9含量增加，且呈现良好的剂量-效应关系。相应地，细胞中非活化的Caspase-3表达量降低，活化的Caspase-3表达量上调。同时，Ru-HMIP作用于Bel-7402后，细胞质中细胞色素C的含量明显升高。另外，另一组重要的与凋亡相关的Bcl蛋白家族分子检测结果显示，Ru-HMIP明显抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并增加了促凋亡蛋白Bax的表达水平。见图4。

PI-A10510410310201051041031020AnnexinV-FITCABCD01021031041050102103104105

A. 空白对照细胞； B. Ru-HMIP(5 μmol/L)处理24 h；

C. Ru-HMIP(10 μmol/L)处理24 h； D. Ru-HMIP(20 μmol/L)处理24 h。Q3.存活细胞； Q4.早期凋亡细胞； Q2.晚期凋亡细胞。

图1Annexin V-FITC/PI双染检测Ru-HMIP诱导Bel-7402细胞凋亡

Figure 1Apoptosis of Bel-7402 cells induced by Ru-HMIP detected by annexinV-FITC/PI assay

121086420140120100806040200AB相对荧光强度相对细胞存活率/%h1O2h1O2+NAC(10mmol?L-1)Ru-HMIPRu-HMIP+NAC(10mmol?L-1)h1O2h1O2+NAC(10mmol?L-1)Ru-HMIPRu-HMIP+NAC(10mmol?L-1)h1O2Ru-HMIP0200400600800100002.55102040c/(μmol?L-1)

A. Ru-HMIP或者H2O2作用于Bel-7402细胞后ROS水平及NAC对其影响； B. Ru-HMIP或者H2O2对Bel-7402的细胞毒性以及NAC对其影响。

图2Ru-HMIP诱发Bel-7402细胞内ROS及其细胞毒性

Figure 2ROS and cytotoxicity on Bel-7402 cells induced by Ru-HMIP

A.空白对照细胞； B. Ru-HMIP(5 μmol/L)处理12 h； C. Ru-HMIP(10 μmol/L)处理12 h； D. Ru-HMIP(20 μmol/L)处理12 h。

图3Ru-HMIP对Bel-7402细胞线粒体膜电位作用 (JC-1染色，200×)

Figure 3Effect of Ru-HMIP on mitochondrial membrane potential of Bel-7402 cells(JC-1,200×)

Bcl-2BaxCaspase-9C-Caspase-9Caspase-3C-Caspase-3Cyto-Cβ-actin1234

1. Con; 2. 5 μmol/L Ru-HMIP; 3. 10 μmol/L Ru-HMIP;

4. 20 μmol/L Ru-HMIP。

图4不同配合物浓度作用细胞凋亡通路相关蛋白WB结果Figure 4Effect of Ru-HMIP at different concentrations on the expression of cell apoptotic proteins

3讨论

线粒体中的一系列代谢过程与细胞发生凋亡密切相关，一些外源性化合物可以诱导呼吸链中ROS的过度生成，通过内源性线粒体凋亡通路诱导细胞发生凋亡[9]。本研究显示，Ru-HMIP可以在Bel-7402细胞中诱导产生大量ROS，继而导致线粒体的内外膜间膜电位崩坍，期间伴随着Bax表达上调，Bcl-2表达下调(图4)。Bcl-2家族成员是线粒体通透性的关键调节者。其中抗凋亡蛋白Bcl-2可以抑制线粒体的通透性，阻滞细胞色素C从线粒体释放，Bax可以与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C的释放，是促凋亡蛋白。此消彼长导致线粒体内膜非特异性孔道产生，导致线粒体膨大，细胞色素C从内膜脱落并流失到胞浆中，激活了相应的Caspase蛋白(图4)。Caspase蛋白家族是细胞凋亡通路重要的蛋白因子，其中Caspase-9活化剪切Caspase-3是线粒体凋亡通路中重要环节[10]。Ru-HMIP作用于Bel-7402后，细胞中非活化的Caspase-9含量降低，而活化型Caspase-9增多。相应地，细胞中非活化的Caspase-3含量下调，活化的Caspase-3上调，而Caspase-3的激活被认为是细胞发生不可逆凋亡的标志。

综上所述，Ru-HMIP能够有效诱导肝癌细胞Bel-7402发生凋亡，其作用机制是在细胞内产生过量的ROS，导致线粒体膜电位下降，继而影响Bcl-2蛋白家族表达量的变化，引起线粒体膜通透性的增强，细胞色素C渗漏到细胞浆中，最后激活了Caspases家族，最终导致细胞发生凋亡。

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(责任编辑：幸建华)

Mechanism of novel ruthenium complex on induction of intrinsic mitochondria-mediated apoptosis in Bel-7402 cells

WANG Jinquan,BO Huaben,CHEN Qizhu

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To study the cytotoxicity and its mechanism of ruthenium complex Ru-HMIP on liver cancer Bel-7402 cells. Methods MTT assay was employed to determine the cytotoxicity of Ru-HMIP. The apoptosis was detected by flow cytometry. The mitochondrial membrane potential was determined by JC-1 probe and the formation of intracellular ROS was measured by DCFH-DA probe. Western blot was performed to study the apoptosis pathway. Results Ru-HMIP inhibited effectively the growth of Bel-7402 cells by induction of cell apoptosis. Ru-HMIP enhanced the production of ROS in Bel-7402 cells,which could be inhibited by NAC. In addition,the cytotoxicity of Ru-HMIP was prohibited by NAC. After treated by Ru-HMIP,the collapse of the mitochondrial membrane potential was found. Meanwhile,the upregulation of Bax,down-regulation of Bcl-2,and activation of Caspase-9 and Caspase-3 were observed. Conclusion Ru-HMIP inhibits the growth of Bel-7402 cells in vitro. The mechanism of Ru-HMIP cytotoxicity is attributed to excess ROS induction in Bel-7402 cells,which destroys the mitochondrial membrane potential and triggers intrinsic mitochondria-mediated apoptosis.

Key words:ruthenium complex; Bel-7402 cells; ROS; apoptosis pathway

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2016011702

中图分类号:R730.2

文献标志码:A

文章编号:1006-8783(2016)02-0238-03

作者简介：王金全(1979—)，男，博士，讲师，主要从事抗肿瘤药物研究，Email：solo_wjq@126.com。

基金项目：国家自然科学基金项目(81403317)；广东省科技计划项目(2015A020211037)

收稿日期：2016-01-17

网络出版时间：2016-04-11 17:03网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160411.1703.005.html