基于Chs基因序列的茎瘤芥起源进化研究

陈发波　姚启伦　董二飞　方 平（长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100）



基于Chs基因序列的茎瘤芥起源进化研究

陈发波姚启伦*董二飞方 平
（长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100）

摘 要：为探讨我国茎瘤芥的起源、进化，克隆、测序了30份茎瘤芥及其近缘种的Chs基因序列，并构建系统发育树、系统发育网络及网状支系结构。结果表明：系统发育树将茎瘤芥及其近缘种Chs基因序列分成3个亚支，9个支系。系统发育网络分析结果表明，茎瘤芥与其他芥菜变种之间不仅存在树状的进化关系，还大量存在非树状的进化史。网状支系分析结果表明，伊犁野生油菜可能是茎瘤芥A基因组的供体，黑芥可能是茎瘤芥B基因组的供体。茎瘤芥为芸薹属芥菜种的一个变种，与薹芥的亲缘关系较近，可能是由薹芥进化而来。单拷贝的Chs基因可作为一个理想的候选基因用于茎瘤芥及其近缘植物多倍体系统发育关系的研究。

关键词：茎瘤芥；Chs基因；起源进化；分子系统学

陈发波，男，博士，副教授，专业方向：作物遗传育种，E-mail：chenfabo963@126.com

茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）属十字花科芸薹属芥菜种，是异源四倍体植物（2n=4x=AABB=36），仅在中国有栽培，其分化年代较晚。茎瘤芥从何种芥菜分化而来？至今尚不清楚。关于茎瘤芥最早的记载是清乾隆51年，在《涪陵县续修涪州志》中有“青菜有苞有籉盐腌名五香榨菜”，说明18世纪中叶以前在四川盆地的长江流域地区已经分化出茎瘤芥；1936年，毛宗良将茎瘤芥变种定名为B. juncea var. tsatsai；1942年，曾勉和李曙轩将茎瘤芥重新命名为B. juncea var. tumida Tsen et Lee（刘佩英，1996）。虽然20世纪40年代初农业科学工作者对榨菜原料曾有过植物学的拉丁文命名，但未确定出一个准确的汉文名称；80年代前期，育种家杨以耕、陈材林等经过进一步的研究和鉴定，将榨菜原料的植物学名称定为茎瘤芥，仍沿用曾勉和李曙轩的拉丁文命名（刘佩英，1996）。周源等（1990）对野生芥菜、栽培芥菜及其原始亲本野生黑芥（B. nigra）与白菜（B. campestris）的过氧化物酶和细胞色素氧化酶同工酶的分析表明，中国西北地区可能是芥菜的起源地。童南奎和陈世儒（1990）研究表明，芥菜的酸性磷酸酶同工酶酶谱与其原始亲本种白菜、黑芥具有较强的同源性，认为菜用芥菜的原始亲本种很可能是起源于中国的野生型黑芥（伊犁油菜）和白菜。陈材林等（1992）研究表明，中国是芥菜原生起源中心或起源中心之一，西北地区是中国的芥菜起源地，中国的栽培芥菜是由原生中国的野生芥菜进化而来，最早出现年代在公元前6世纪以前，其中茎瘤芥最早发现于四川盆地。基于SSR分子标记技术，Fang等（2013）对我国茎瘤芥种质资源进行了遗传多样性分析，推测长江中游的重庆市可能是茎瘤芥的起源地或遗传多样性中心，在其传播过程中主要是以重庆市为中心，沿长江流域向其上游和下游传播。

查尔酮合成酶基因（Chs）主要调控类黄酮物质的合成，为单拷贝基因（Durbin et al.，1995）。Chs基因普遍存在于植物中，现认为最早在陆生植物中出现，例如轮藻纲和苔藓植物（Jiang & Cao，2008；Lu et al.，2009）。Lanz等（1991）指出Chs在植物的不同类群中是很保守的，已有数据表明Chs基因是一个较大的基因家族，其编码区比较保守，长约1.2 kb，不同科之间的氨基酸同源性为70～90个。Niesbach-Klösgen等（1987）首次尝试利用Chs基因编码区的DNA序列来研究物种的进化关系，结果表明毛茛属植物与欧芹属植物的分类结果与基于表型的分类结果不一致。Zhao等（2010）利用Chs基因分析了十字花科60个属间的系统关系，认为Chs基因序列可作为十字花科不同属间系统关系分析的候选基因。但对茎瘤芥起源进化的分子系统学研究至今未见报道，为此本试验克隆、测序了30份茎瘤芥及其近缘植物的Chs基因，构建茎瘤芥及其近缘植物的系统发育树、系统发育网络及网状支系结构，探讨茎瘤芥及其近缘植物（芸薹属）的起源进化，为茎瘤芥远缘杂交和种质扩增提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

表1　供试材料名称、来源及GenBank登录号

供试材料为茎瘤芥及其近缘种和外类群萝卜属的不同栽培种30份，材料编号、来源及序列GenBank登录号见表1，分类及拉丁名主要参考周太炎等（1987）、刘佩瑛（1996）及王建林等（2006）对中国茎瘤芥植物的分类研究。

1.2DNA提取

试验于2013年5月在长江师范学院三峡库区特色作物工程中心进行，将供试30份材料种子分别置于培养箱中发芽，取幼苗叶片约3 g在液氮中研磨，采用2×CTAB法提取并纯化基因组DNA （Doyle & Doyle，1987）。

1.3PCR扩增及DNA测序

PCR扩增片段为Chs基因第1和第2外显子约1 200 bp序列，扩增通用引物序列为CHS-F：5′-CTTCATCTGCCCGTCCATCATACC-3′，CHS-R：5′-GGAACGCTGTGCAAGAC-3′（Zhao et al.，2010），引物由上海英俊生物技术有限公司合成。PCR体系（25 μL）包含：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下游引物（10 nmol·mL-1）各2 μL，DNA 1 μL（含50 ng DNA），RNase Free Water 7.5 μL。2×Taq MasterMix由北京康为世纪生物科技有限公司提供。PCR反应程序为：95 ℃变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。采用爱思进生物技术（杭州）有限公司生产的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行目的DNA回收、纯化。将扩增产物连接到质粒载体PMD18-T（TaKaRa）后，再转染感受态大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素的培养基上培养感受态菌株，挑取3～5个阳性克隆，DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成。利用DNAMAN 6.0软件进行序列比对，分析异源四倍体得到的拷贝类型，设计不同基因组Chs基因的特异引物。筛选到A基因组特异引物为PA-F：5′-GGAACGCTGTGCAAGAC-3′，PA-R：5′-GCATTGATCAACCTCTTGTAACT-3′；B基因组特异引物为PB-F：5′-GGAACGCTGTGCAAGAC-3′，PB-R：5′-TTGCATAAAGTCACACATCC-3′。

1.4数据分析

利用ClustalX（2.0）软件对获得的Chs基因序列进行多重排定，序列排好后辅以手工校正（Thompson et al.，1997）。使用DNAMAN软件包（version 6.0，Lynnon Biosoft）进行序列比对分析。系统发育分析采用最大似然法（maximum likelihood，ML），ML分析采用PAUP 4.0b10软件，贝叶斯推断采用MrBayes 3.1.2软件进行模型和参数估计（Huelsenbeck & Ronquist，2001），基于hLRT标准选择的最适碱基替代模型为TIM+I+G。ML分析采用启发式搜索（heuristic searches）和树二等分再连接（tree-bisectionreconnection，TBR）进行系统树构建，并采用自展值分析（bootstraps，BS）进行检验，自展分析进行500次。利用Splits tree 4软件，采用二分裂法构建茎瘤芥及其近缘植物系统发育网络。采用系统网状重建法（phylogenetic network reconstruction method）分析种群单体型的系谱关系。首先利用HyPhy软件的GARD方法分别检测Chs基因外显子、内含子及外显子+内含子的重组信息，结果表明Chs基因外显子为非重组DNA序列（Log Likelihood=-5816.39，AIC=47251.54），利用外显子序列数据资料构建网状支系图（Bandelt et al.，1999；Pond et al.，2005）。采用Network 5.4.4.0软件（Fluxus Technology Ltd，Clare，Suffoik，UK）的中介连接网络法（median-joining network method）进行网状支系分析。

2　结果与分析

2.1系统发育树分析

将获得的52个Chs基因DNA序列（含外类群）多重排定，可以得到1 454个排列位点（total site），其中保守位点（conserved site）1 132个，占总位点的77.85%；可变位点（variable sites）321个，占总位点的22.08%；简约信息位点（parsimony information）188个，占可变位点的58.57%。采用最大似然法（ML）构建系统发育树，4种核苷酸的碱基频率分别为：A=23.36%，T=21.46%，C=27.20%，G=27.98%，似然值为-3 585.631，γ形值（gamma shape parameter）为0.099 3。

从图1可知，供试材料分为芸薹属和萝卜属两大分支，芸薹属又分为A、B、C 3个亚支。其中EF408922为GenBank下载的A基因组序列。A亚支包括A1、A2、A3和A4支系，均为A基因组Chs基因序列。A1支系只包括涪陵野生油菜，为二倍体材料；A2支系包括宽柄芥和甘蓝型油菜，为异源四倍体材料；A3支系包括结球芥、卷心芥、大头芥、野生芥菜、凤尾芥、笋子芥、小叶芥、分蘖芥、芥菜型油菜、白花芥、伊犁野生油菜和花叶芥，除伊犁野生油菜为二倍体外，其余都为异源四倍体材料；A4支系包括大白菜、大叶芥、普通白菜、叶瘤芥、茎瘤芥、薹芥、长柄芥和抱子芥，除大白菜和普通白菜为二倍体外，其余都为异源四倍体材料。B亚支包括B1、B2、B3和B4支系，均为B基因组Chs基因序列。B1支系只包括分蘖芥，为异源四倍体材料；B2支系只包括芥菜型油菜，为异源四倍体材料；B3支系包括大头芥和埃塞俄比亚芥，为异源四倍体材料；B4支系包括白花芥、卷心芥、野生芥菜、笋子芥、茎瘤芥、小叶芥、花叶芥、长柄芥、黑芥、宽柄芥、结球芥、薹芥、叶瘤芥、抱子芥、大叶芥和凤尾芥，除黑芥为二倍体外，其余都为异源四倍体材料。C亚支包括甘蓝型油菜、结球甘蓝和埃塞俄比亚芥，都为C基因组Chs基因序列。从以上分析可以看出，Chs基因能够将茎瘤芥及其近缘植物与外类群萝卜属很好地分开，而且不同基因组间分化程度不一样，A基因组分化相对较大，B基因组分化相对较小，Chs基因可作为一个理想的候选基因用于茎瘤芥及近缘植物系统关系的研究。

图1　基于中国茎瘤芥及其近缘种Chs基因序列的ML系统发育树

2.2系统发育网络进化分析

从图2可知，52个Chs基因序列分成4个明显的分支。第I分支都为A基因组Chs基因序列；第Ⅱ分支都为B基因组Chs基因序列；第Ⅲ分支为芸薹属外类群萝卜属Chs基因序列；第Ⅳ分支都为C基因组Chs基因序列。从分支数看，B基因组分化相对较小，A基因组分化相对较大，与系统发育树结果基本一致。从图2还可以看出，茎瘤芥及其近缘植物间不仅存在树状的进化关系，还存在非树状的进化史，在茎瘤芥及其近缘植物进化史上可能存在较多的网状进化事件。单拷贝的Chs基因可作为一个较好的候选基因用于茎瘤芥及其近缘植物多倍体系统发育关系的研究。

2.3网状进化关系分析

Chs基因序列网状结构为4个主要的星状结构，不同基因组Chs基因能较好的形成直系同源系列（图3）。第I个星状结构都为A基因组Chs基因序列，其中茎瘤芥与薹芥位于同一个变异位点，伊犁野生油菜、野生芥菜、笋子芥、小叶芥、白花芥和分蘖芥处于星状结构的中心，伊犁野生油菜为二倍体，说明伊犁野生油菜可能是芥菜A基因组亲本的供体。第Ⅱ个星状结构都为B基因组Chs基因序列，其中茎瘤芥与白花芥、野生芥菜、笋子芥、小叶芥、花叶芥、长柄芥、黑芥、宽柄芥、结球芥、薹芥、叶瘤芥、抱子芥、大叶芥和凤尾芥在同一个变异位点，并处于星状结构的中心，黑芥为二倍体材料，其他都为异源四倍体材料，说明黑芥可能是芥菜B基因组亲本的供体。第Ⅲ个星状结构为芸薹属外类群萝卜属Chs基因序列。第Ⅳ个星状结构都为C基因组Chs序列。由以上分析可知，茎瘤芥与薹芥亲缘关系最近，伊犁野生油菜可能是茎瘤芥A基因组亲本的供体，黑芥可能是茎瘤芥B基因组亲本的供体。

图2　基于Splits tree分析的茎瘤芥及其近缘种网状进化式样

图3　基于A、B基因组Chs基因序列构建的MJ网状支系图

3　结论与讨论

3.1关于利用Chs基因研究茎瘤芥起源进化的可行性分析

在植物中，建立在物种生物系统学基础上的基因组分析已被大多数研究者所接受（Kroon et al.，2004；Yockteng & Nadot，2004）。单拷贝核基因很少发生协同进化且含有更多的系统发生信息，这使得单拷贝核基因在植物分子系统学研究中可作为理想的载体来演示多倍体物种的形成过程和供体来源等（Straub et al.，2006；Sun et al.，2008）。由于能提供较多的信息和较高重组性（Kano et al.，1999），Chs基因已应用于十字花科植物系统发育研究（Zhao et al.，2010）。另外，由于具有双亲遗传的特点，Chs基因序列已应用于植物起源进化和多倍体物种起源进化的研究（Zhao et al.，2010）。本试验获得了52个Chs基因序列，共得到1 454个排列位点，其中保守位点1 132个，占总位点的77.85%；可变位点321个，占总位点的22.08%；简约信息位点188个，占可变位点的58.57%。系统发育树将茎瘤芥及其近缘种Chs基因序列分成3个亚支、9个支系。茎瘤芥系统分类地位与前人研究相同（刘佩英，1996），应为芸薹属芥菜种的一个变种。系统发育网络分析结果表明，茎瘤芥及其近缘植物间不仅存在树状的进化关系，还大量存在非树状的进化史，在茎瘤芥及其亲缘植物进化史上存在较多的网状进化事件。网状支系分析结果表明，不同基因组Chs基因能较好的形成直系同源系列。因此，单拷贝的Chs基因可作为一个理想的候选基因用于茎瘤芥及其近缘植物多倍体系统发育关系的研究。

3.2茎瘤芥起源进化的探讨

茎瘤芥仅在中国有栽培，其起源于中国的何地？是从哪一种芥菜中分化出来的？至今研究报道较少。一些学者根据形态上的差异，认为茎瘤芥最初由野生芥菜（B. juncea）进化而来，其进化次序是野生芥菜（B. juncea）→大叶芥（B. juncea var. rugosa）→笋子芥（B. juncea var. crassicaulis）→茎瘤芥（B. juncea var. tumida）（刘佩英，1996）。本试验中，从系统发育树分析可知，茎瘤芥为芸薹属芥菜种的一个变种，茎瘤芥A基因组Chs基因序列与薹芥、叶瘤芥、长柄芥、抱子芥和薹芥为一个姊妹组（自展值为89%），茎瘤芥B基因组Chs基因序列与薹芥、白花芥、卷心芥、野生芥菜、笋子芥、小叶芥、花叶芥、长柄芥、宽柄芥、结球芥、叶瘤芥、抱子芥、大叶芥和凤尾芥在一个姊妹组（自展值为99%）。系统发育网络分析表明，茎瘤芥与其他芥菜变种之间不仅存在树状的进化关系，还存在非树状的进化史，这可能与芥菜不同变种之间可以自由授粉有关。星状结构表明，茎瘤芥A基因组与薹芥位于同一个变异位点，茎瘤芥B基因组也与薹芥位于同一个变异位点；伊犁野生油菜可能是茎瘤芥A基因组的供体，黑芥可能是茎瘤芥B基因组的供体，这与Song等（1988）、童南奎和陈世儒（1990）、周源等（1990）、Truco等（1996）的研究结果一致，都认为中国芥菜的原始亲本种可能是黑芥和白菜。据记载，中国芥菜产生的时间距今约8 000年，而关于茎瘤芥的历史记载仅数百年（刘佩英，1996）。因此，笔者推测茎瘤芥不是由白菜和黑芥杂交后直接进化而来的，而是由白菜和黑芥杂交后产生的某种芥菜发生天然突变、再经人工驯化选择产生的。薹芥与茎瘤芥亲缘关系最近，推测茎瘤芥可能是由薹芥分化而来的。

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Studies on Origin and Evolution of Tuber Mustard（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）based on Chs Gene Sequences

CHEN Fa-bo，YAO Qi-lun*，Dong Er-fei，FANG Ping
（Department of Life Sciences and Technologies，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China）

Abstract：In order to explore the origin and evolution of tuber mustard（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee），we cloned and sequenced the Chs gene sequences of tuber mustard and its close relative species．As illustrated in the phylogenetic tree，the sequences from all Brassica taxa were separated into three well supported clades and nine sub-clades．Splits tree analysis indicated that there existed not only tree evolution，but also reticulate evolution among tuber mustard and its related plants．Median-joining（MJ）network analysis showed that B. rapa and B. nigra were the parental donors of A genome and B genome in allotetraploid B. juncea tumida，respectively．Tuber mustard，as a variety of B. juncea，was closely related to B. juncea var. utilis，indicating that B. juncea tumida might originate from B. juncea var. utilis．In addition，the single copy gene Chs could be efficiently applied to evaluate the phylogenetic relationships of tuber mustard its and related plants.

Key words：Tuber mustard；Chs gene；Origin and evolution；Molecular systematics

*通讯作者（

Corresponding author）：姚启伦，男，教授，硕士生导师，专业方向：作物遗传育种，E-mail：yql641@aliyun.com

收稿日期：2015-07-04；接受日期：2015-10-12

基金项目：教育部科技司资助项目（Z2011143），重庆市教委资助项目（KJ121304），重庆市涪陵区科委计划项目（FLKJ2012ABB1085）