全自动DNA定量技术能提高支气管镜刷片中肿瘤细胞的阳性检出率

郭　睿, 杨　军, 苏宝山, 康安静, 马　莉, 肖　娇(西安交通大学第二附属医院病理科,西安　710004, 通讯作者, E-mail: yangjundr@163.com)



全自动DNA定量技术能提高支气管镜刷片中肿瘤细胞的阳性检出率

郭睿, 杨军*, 苏宝山, 康安静, 马莉, 肖娇(西安交通大学第二附属医院病理科,西安710004,*通讯作者, E-mail: yangjundr@163.com)

摘要：目的探讨DNA定量技术肺癌筛查和早期诊断中的应用价值。方法 对181例肺部疾病患者进行纤维支气管镜取活检并刷检。活检组织经常规固定、石蜡包埋、HE染色后进行病理检查；留取部分刷取物制作刷片，常规固定、HE染色后进行常规细胞学检查，剩余刷取物放入麦克奥迪DNA倍体样本处理试剂中固定，悬滴法制作涂片，经Feulgen染色，采用Motic全自动细胞DNA定量分析系统进行细胞DNA定量分析。对比分析细胞DNA定量分析与传统支气管刷片的敏感度和特异度。结果采用全自动DNA定量技术检测纤维支气管镜刷检物中肿瘤细胞的灵敏度为87.30%、显著高于传统纤维支气管镜刷片的灵敏度52.38%,但特异度(80.5%)较其低。结论全自动DNA定量技术是一种敏感而特异的肺癌筛查和早期诊断技术，能提高纤维支气管镜刷检物中肿瘤细胞检出率。

关键词：DNA定量分析;DNA含量;肺肿瘤

肺癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。近50年来，其发病率、死亡率呈现逐年增高趋势[1-3]。胸部X线检查、痰细胞学检查和纤维支气管镜刷检是肺癌普查和诊断的有效方法，其中，通过纤维支气管镜检查并进行刷检、钳夹活检、支气管肺泡灌洗是最为可靠的肺癌诊断方法。但其低敏感性并不能满足肺癌临床诊断的需要，特别是对于早期病变和周围性病变而言，假阴性率更高。因此，提高纤维支气管镜的阳性检出率具有重要的临床价值。近年来，一种基于显微分光光度与图像处理分析技术的全自动细胞DNA定量技术(automatic DNA quantitative analysis technology)的全自动细胞DNA图像分析技术(automatic DNA image cytometry,DNA-ICM)以其敏感性高、重复性强、结果客观等特点为细胞病理学检测提供了一种可靠的方法，已用于包括宫颈细胞学筛选在内的多种脱落细胞学样本和组织学样本的检测中[4-9]。本文对部分肺部疾病患者的DNA定量诊断结果与病理结果进行了对照研究，探讨了全自动 DNA定量分析技术在肺癌诊断中的价值。

1资料与方法

1.1临床资料

收集西安交通大学第二附属医院病理科2012-10～2014-03纤维支气管镜刷检病例共181例(其中男性125例，女性56例，年龄21-81岁)，所有病例均经活检组织学诊断和/或临床确诊。63例肺癌患者，本院活检确诊57例，余6例临床经外院活检或其他检查最终确诊。良性病变患者118例，本院活检确诊50例，余68例经其他检查最终确诊。所有病例均同时进行常规支气管刷片和全自动细胞DNA分析。

1.2方法

1.2.1样本取材及制片采用Olympus BF-1T260型电子纤维支气管镜进行常规刷检和活检，刷取物常规涂片4-6张用95%酒精+5%冰乙酸常规固定、其余刷取物加入麦克奥迪DNA分析样本处理瓶中固定，活检组织、经皮肺穿活检或术后标本组织样本采用10%福尔马林固定、常规制片。

1.2.2诊断支气管刷片和活检组织均经HE染色，由具有临床资质的病理医师阅片并按照WHO标准进行病理诊断，其中刷片诊断根据Papanicolaou细胞学分级评价标准：①Ⅰ级(正常)，无不典型或异常细胞；②Ⅱ级(不典型增生)，有不典型细胞，但无恶性证据；③Ⅲ级(疑癌细胞)，细胞学提示可能恶性，但无恶性证据；④Ⅳ级(高度可疑癌细胞)，细胞学强烈提示可能恶性；⑤Ⅴ级(癌细胞)，细胞学为恶性。以Ⅲ-Ⅴ级判定为细胞学检查阳性。

1.2.3细胞DNA定量分析所有的含保存液的181例DNA检测样本均经离心、取沉淀，重悬滴片、自然风干、固定，Feulgen染色，质控片采用大鼠肝细胞片作对照。按照麦克奥迪全自动细胞DNA定量分析系统操作说明进行参数设定、玻片扫描和分析。以DNA指数(DNA Index，DI)表示DNA含量，以DI>2.5判读为异倍体细胞(aneuploidy)。①阳性病例：异倍体细胞数≥3个、或可见细胞异倍体峰(在1.05

1.3统计学分析

采用SPSS19.0软件进行χ2检验，以P<0.05判断为差异有统计学意义，同时计算灵敏度和特异度。

2结果

2.1活检、常规支气管刷片、全自动DNA定量分析结果

在该组病例中，活检和临床证实良性病变患者118例(包括支气管黏膜炎113例、肺结核3例、真菌感染1例、气管异物1例)，肺癌患者共63例(包括鳞癌24例、腺癌11例、小细胞未分化癌9例和其他类型癌19例)；支气管刷片阴性者占76.80%(139/181)、不典型增生者占14.92%(27/181)、阳性者(诊断为Ⅲ-Ⅴ级，包括癌疑细胞、高度癌疑细胞和癌细胞)占8.28%(15/181)。181例支气管刷检样本中DNA定量分析检测，良性病变组绝大部分细胞为二倍体, 肺癌组可见大量异倍体细胞,DI≥3者占30.39%(55/181)、DI为1-2者占12.71%(23/181)、DI为0者占56.90%(103/181)(见图1)。统计学分析结果显示：全自动细胞DNA定量分析结果与组织学检测和传统细胞学检测方法结果之间差异有统计学意义(P<0.001，见表1，2)。

2.2常规支气管刷片与全自动DNA定量技术敏感度和特异度分析

以活检和临床诊断为标准，以DI≥1作为阳性界值计算全自动细胞DNA定量分析技术的灵敏度为87.30%、特异度为80.51%(见表3)。而在常规纤维支气管刷片中，以不典型细胞、癌疑细胞、高度癌疑细胞和癌细胞合计作为阳性细胞计算的常规纤维支气管镜刷片的灵敏度为52.38%、特异度为92.37%(见表4)。结果显示全自动细胞DNA定量技术的灵敏度显著高于常规支气管刷片，但其特异度较常规支气管刷片低。

3讨论

众所周知，细胞DNA含量是比较恒定的细胞物理参数，正常人体细胞多为二倍体细胞，DNA含量恒定，大约为7 pg。致癌因素引起的基因突变、丢失、异常扩增或染色体移位、融合等被认为是肿瘤发生的早期分子事件，并导致细胞DNA含量的增加。因此，准确测定细胞DNA含量的微小异常变化，发现异常细胞，成为使用DNA-ICM技术进行肿瘤极早期诊断的理论基础[12,13]。

采用白光显微分光光度与自动细胞图像分析技术的DNA-ICM技术通过对Feulgen染色的细胞涂片进行扫描，并快速直观地进行逐个细胞核积分吸光度(IOD)的检测，计算细胞核DNA含量，并常用DNA指数(DNA index，DI)来表示DNA含量：DI=被测细胞IOD值/正常细胞DNA(G0/G1期)IOD平均值。一般认为，一旦检测到DI>2.5的异倍体细胞，或出现较多DI值为1.1-1.9的异倍体细胞，且聚集成峰，提示存在恶性瘤细胞。因此，多种全自动细胞DNA定量分析相关设备已被广泛应用，主要有德国Leitz MPVⅢ型光度计扫描系统、加拿大的AeCell系统和MOTIC系统等。目前，DNA-ICM技术以其较高的敏感性和特异性已被用于包括宫颈在内的多种类型脱落细胞学标本的检测和恶性实体肿瘤恶性程度的评估，并已证实，DI和异倍体细胞数与细胞增殖、恶性程度及不良预后呈正相关[14-16]。

图1　三组患者支气管刷取物细胞DNA图像分析比较Figure 1　Analysis and comparison of the DNA images by bronchial brush from three kinds of patients

表1DNA定量分析检测结果例(%)

Table 1Quantitative analysis of DNA of bronchial brush extractcases(%)

组织学诊断n异倍体细胞数01-2≥3χ2P 良性病变组118(65.19)95(52.49)13(7.18) 10(5.52)87.5180.000 肺癌组 鳞癌24(13.26)4(2.21) 2(1.10)18(9.94) 腺癌11(6.08) 2(1.10)1(0.55)8(4.42) 小细胞癌9(4.97) 0(0) 6(3.31)3(1.66) 其他类型癌19(10.50)2(1.10) 1(0.55)16(8.84) 合计181(100.0) 103(56.91) 23(12.71)55(30.39)

表2常规支气管刷片检测结果例(%)

Table 2Results of conventional bronchial brush extract cases(%)

细胞学诊断n异倍体细胞数01-2≥3χ2P阴性(Ⅰ级)139(76.80) 96(53.04)19(10.50)24(13.26) 50.9050.000不典型增生(Ⅱ级)27(14.92)6(3.31)2(1.10)19(10.50)阳性(Ⅲ-Ⅴ级)15(8.28)1(0.55)2(1.10)12(6.63) 合计181(100.0)103(56.91)23(12.71)55(30.39)

表3DNA定量分析灵敏度和特异度

Table 3DNA quantitative analysis of sensitivity and specificitycases(%)

活检全自动DNA定量分析阳性阴性合计灵敏度特异度阳性5586387.30%80.51%阴性2395118合计78113181

表4常规支气管刷片灵敏度和特异度分析

Table 4Sensitivity and specificity of conventional bronchial brushcases(%)

活检全自动DNA定量分析阳性阴性合计灵敏度特异度阳性33306352.38%92.37%阴性9109118合计42139181

该研究应用麦克奥迪生产的MotiCytometer全自动细胞DNA图像定量分析系统对181例纤维支气管镜刷检细胞样本进行细胞DNA含量检测，发现全自动细胞DNA定量分析技术与常规活检和常规纤维支气管镜刷片检测之间有统计学差异。以活检和临床最终诊断作为标准，结果提示全自动细胞DNA定量分析技术具有很好的灵敏度(87.30%)和一定的特异度(80.51%)，且其灵敏度显著高于常规纤维支气管刷片的灵敏度(52.38%)。而其特异度(80.51%)较常规纤维支气管刷片的特异度(92.37%)低，可能与以下因素有关：首先，在细胞癌变过程中，由于细胞DNA含量的变化早于细胞形态学的变化，当DNA定量分析发现的异倍体细胞在细胞学水平上并未显示出足以判断为异常细胞的形态学异型性，因而，活检和细胞学检查时并不能发现异常。同时，该组病例均经单次活检和临床诊断作为标准，进行全自动细胞DNA定量技术敏感性和特异度分析，不排除部分患者存在由于肿瘤部位或活检取材不当导致的活检假阴性的可能。

总之，作为一项肺癌筛查和早期诊断方法，全自动细胞DNA定量分析技术以其87.30%的灵敏度和80.51%的特异度，能显著提高纤维支气管镜刷检的阳性检出率，是一种敏感而特异的肺癌筛查和早期诊断技术，尽管价格较高，但由于其具有操作简单、结果客观准确、重复性的特点，仍适于大范围推广应用。

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Automatic DNA image cytometry can improve the positive detectable rate of cancer by fiberobronchoscopy

GUO Rui, YANG Jun*, SU Baoshan, KANG Anjing, MA Li, XIAO Jiao

(DepartmentofPathology,SecondHospitalofXi’anJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Xi’an710004,China；*Correspondingauthor，E-mail:yangjundr@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the application value of automatic DNA image cytometry(DNA-ICM) in screening and early diagnosis of lung cancer. MethodsFresh cytology and biopsy specimens were taken by fiberobronchoscopy from 181 cases of pulmonary disease. Biopsy samples were conventionally fixed, paraffin embedded and stained with HE for pathological examination. Some of brush extract was used to prepare bronchial smear for cytological examination. The rest brush extract was fixed in MotiC®TMcell preservation liquid for making a thin smear by hanging drop. After stained with Feulgen, the thin smear was measured for DNA index(DI) using MotiC Automatic DNA image cytometry(Motic Xiamen Co.,Ltd.).Finally, the sensitivity and specificity of DNA-ICM and traditional bronchial brush smear were analyzed.ResultsThe sensitivity and the specificity of DNA-ICM in fiberobronchoscopy were 87.30% and 80.51% respectively. The sensitivity of DNA-ICM was significantly higher than that of traditional bronchial brush smear(52.38%,P<0.01). ConclusionDNA-ICM is a sensitive cytological technology for screening and early diagnosing lung cancer, and it can improve the positive detectable rate of tumor cells in fibrobronchoscopy.

Key words:automatic DNA image cytometry(DNA-ICM);DNA content;lung carcinoma

[收稿日期：2015-09-21]

作者简介：郭睿，女，1981-07生，硕士，医师，E-mail:25815166@qq.com.

中图分类号：R734.2

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)01-00102-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.025

基金项目：卫生部医药卫生科技发展研究中心(W2012GJ03)