光动力学疗法对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及细胞周期的影响

乔　丽, 杨志勇, 许成山， 刘　玮(中国人民解放军空军总医院皮肤科，北京　004； 中国人民解放军空军总医院中心实验室)



光动力学疗法对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及细胞周期的影响

乔丽1, 杨志勇1, 许成山2， 刘玮1(1中国人民解放军空军总医院皮肤科，北京100142；2中国人民解放军空军总医院中心实验室)

摘要：目的探讨5-氨基乙酰丙酸-光动力学疗法(ALA-PDT)对体外培养的人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及其细胞周期的影响。方法以体外培养的人皮肤鳞状细胞癌A43l细胞株为研究对象，一组为对照组(不处理)，另一组为ALA-PDT组(0.4 mg/ml的ALA避光孵育3 h后行激光照射)，银染细胞后镜下观察，并计算核仁组成区的相对面积；采用流式细胞术分析光动力学治疗后各细胞周期中细胞分布比例，并计算增殖指数。结果光动力学治疗后A43l细胞株细胞内核仁组成区的相对面积显著降低。流式细胞仪检测结果表明光动力学治疗组S期峰低于对照组，S期细胞比例显著降低为(9.2±2.1)%。对照组和光动力学治疗组的增殖指数分别为(47.0±3.4)%和(31.1±3.1)%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论5-氨基乙酰丙酸-光动力学疗法能够抑制A43l细胞株的过度增殖，改变其细胞周期分布。

关键词：光动力学疗法；皮肤鳞状细胞癌；增殖指数；嗜银蛋白；细胞周期

鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)简称鳞癌，是常见的皮肤恶性肿瘤之一，目前其发病机制尚不十分清楚[1]，其危害性大，激光照射、冷冻、电灼等传统疗法不能完全杀死癌细胞，并且可刺激肿物迅速增生。手术治疗虽可完全清除肿瘤，但会在颜面等要求美观的暴露部位留有瘢痕，给接受美容者造成极大痛苦。光动力治疗是一种微创疗法，应用ALA-PDT治疗癌前病变及皮肤肿瘤的方法在欧美已有较深入的研究与应用，但由于人种等原因国内该方面的临床应用和研究甚少。细胞增殖与细胞周期及核仁组成区相关嗜银蛋白(argyrophilic protein in nucleolar organizer regions，AgNORs)的表达关系密切[2]。本研究采用5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)对A431细胞进行光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)，通过银染法检测A431细胞中AgNORs的表达，并通过流式细胞术分析细胞周期的变化，以了解PDT对A431细胞的影响。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

试剂5-ALA购于Sigma公司；荧光染料碘化丙啶购于北京德广兴生物科技有限公司；630 nm半导体红光激光器(桂林兴达光电医疗器械有限公司)；LM-93Ⅱ型激光功率计(中国计量院)；Olympus-BH2型生物显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2细胞培养

A431细胞(本实验室保藏)于含10%胎牛血清的DMEM培养基、37 ℃、5%CO2条件下培养，每3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液。按1∶2比例传代，建立病理性A431细胞的传代细胞系，实验用第4-6代细胞，待细胞70%-80%融合时用于流式细胞仪检测和细胞爬片染色。

1.3PDT处理和实验分组

将培养的A431分为对照组和PDT组，PDT组的A431细胞与0.4 mg/ml的ALA避光孵育3 h后行激光照射(波长630 nm，功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2)，照射前后均监测输出功率，输出功率波动范围<±5%；PDT后继续将细胞放回孵箱中孵育20 h，再进行下一步实验检测。对照组不给予光敏剂和激光照射处理。每组实验重复5次。

1.4AgNORs检测方法

AgNORs染色将细胞爬片低渗处理后，加入固定液室温固定20 min；按要求分别滴加A、B染液，混匀，加盖玻片，4 min后待染液变为深黄色，取出净水冲洗，自然晾干；染色的细胞爬片置于图像分析系统的高倍显微镜下，S形移动玻片，计数60个A431细胞核仁银染面积与细胞核银染面积灰度比值。

1.5细胞增殖周期检测

采用荧光染料碘化丙啶一步法染色。细胞处理后消化，PBS洗2次，70%乙醇固定，制成单细胞悬液106/ml，存4 ℃冰箱。上机前0.5 h加碘化丙啶(Sigma)DNA染色。用流式细胞仪进行DNA分析，经荧光光通量积分后得到DNA含量分布曲线，后通过Modfit 3.0软件进行细胞周期时相分析，统计增殖指数(proliferation index，PI)，表示对A431细胞增殖的影响，其计算公式如下：PI=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%。

1.6统计学方法

2结果

2.15-ALA-PDT对A431细胞中AgNORs的影响

在所有A431细胞核内都可明显见到AgNORs颗粒，呈棕褐色至深黑色，圆形或形状不规则，有的周围有空晕，界限清楚，散在分布，常位于细胞核中央或偏位。对照组A431细胞核内核仁浓染、染色质增多增粗、分布不均匀，可明显见到银染颗粒，真皮层A431细胞中核仁与细胞核银染面积灰度比值为8.264±2.04；治疗组A431细胞内AgNORs颗粒较对照组明显减少(见图1)，为5.234±1.74，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

A.对照组　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.ALA-PDT组图1　ALA-PDT对A431中AgNORs的影响 (荧光显微镜，×200)Figure 1　Effect of ALA-PDT on AgNORs in A431 cells (×200)

2.25-ALA-PDT对A431细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果表明：两组细胞均以G0/G1期细胞为主峰，对照组A431中S期细胞峰高，为21.2%。PDT组S期、G2+M期细胞峰光滑平坦，S期比例显著降低，PI含量显著降低(见图2)。两组PI值差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

组别G1期S期G2期PI对照组63.0±5.321.2±2.915.8±2.147.0±3.4ALA-PDT71.7±5.79.2±2.119.1±2.331.1±3.1*

与对照组比较,*P<0.05

A.对照组　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.ALA-PDT组图2　ALA-PDT治疗后A431各期细胞比例分布Figure 2　The cell percentage distribution of A431 cells at each stage after treated with ALA-PDT

3讨论

PDT杀伤肿瘤细胞可能的机制有以下几种：PDT光能转化过程中产生的单线态氧和ROS可以对很多大分子物质，包括蛋白质、核酸等产生损害，引起细胞凋亡或坏死[3,4]；PDT损伤肿瘤血管的内皮细胞，引起肿瘤血管栓塞，导致肿痛组织微循环障碍，肿瘤细胞缺血坏死[5]；PDT能够刺激机体免疫系统产生免疫反应，对抗肿瘤细胞，比如，T淋巴细胞的功能对于维持PDT抗肿瘤的长期疗效是必需的。这几种机制在PDT引起靶组织的破坏过程中都有一定的作用[7,8]。其作用因光敏剂的不同而不尽相同[9]。但是，至今对这些机制中PDT发挥的确切作用尚无明确的研究能够表明。

目前研究发现由5-ALA引起的皮肤等正常组织的光敏作用只需要1-2 d就能被消除[10,11]。目前，5-ALA在皮肤癌、食道癌、胃肠道癌及肺癌等领域已经研究相当广泛，并且已经有相当程度的临床应用。与目前的手术、化疗或放疗相比，其具有一定的对肿瘤细胞的选择性，具有对正常细胞损伤小；无蓄积毒性，可以多次使用，不产生耐药性；副作用小，可安全应用于老年人和体弱无法手术者等优点。

A431细胞具有肿瘤细胞的特性，处于高增殖、高代谢和高分泌状态。国外学者认为A431细胞中AgNORs较正常细胞增多，表明A431细胞内DNA转录活跃，细胞处于高度增殖和蛋白合成分泌旺盛的状态[12,13]。为了给细胞的快速生长创造条件，A431细胞对某些糖类、氨基酸等的运送能力比正常细胞要大，细胞膜在细胞与外环境物质交换过程中起着重要作用[14,15]。A431细胞膜的通透性亦高于正常细胞，使ALA易于进入A431细胞。

AgNORs可以早而精确地反映细胞的增殖能力和蛋白质合成状态，及核仁的结构和功能变化。我们的研究将A431细胞与5-ALA避光孵育后行PDT治疗，通过计算AgNORs的相对含量来评估治疗效果。细胞银染后在镜下观察到，对照组A431细胞中核仁浓染、染色质增多增粗、分布不均，说明A431细胞核酸代谢强，细胞DNA合成速度快，含量高。而PDT组细胞AgNORs减少，细胞核仁与细胞核银染面积比值较对照组明显降低，表明5-ALA-PDT治疗后，A431细胞中AgNORs的表达减少，亦即PDT能在一定程度上抑制体外培养A431细胞的增殖能力和代谢功能。细胞周期反映单个细胞的生长过程，正常皮肤细胞主要分布在静止期(G0、G1期)。从实验结果可以看到，对照组A431处于增殖状态(G2、S和M期)，其中S期细胞百分比达到(21.2 ±2.9)%。由于S期是细胞增长的重要时期，其主要特征是DNA合成旺盛，因此高比例的S期细胞，反映细胞的增殖活跃。经ALA-PDT治疗后，A431细胞的DNA合成前期持续时间延长，处于G0/G1期的细胞比例升高，而处于DNA合成期的细胞比例降低，表明ALA-PDT可以延缓A431细胞由G1期向S期的过渡，使大多数细胞停滞于DNA合成前期，导致DNA合成障碍，最终致使细胞的数量增长减慢，A431细胞的倍增时间延长，这与镜下观察到的AgNORs表达变化相一致。同时，两组A431细胞的PI值亦相应下降，且差异有统计学意义。这些结果皆表明ALA-PDT改变了各期细胞的分布比例，抑制A431细胞增殖。

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Effect of photodynamic therapy on the proliferation and cell cycle of human squamous carcinoma A431 cells

QIAO Li1, YANG Zhiyong1, XU Chengshan2, LIU Wei1

(1DepartmentofDermatology,AirForceGeneralHospitalPLA,Beijing100142,China；2CentralLaboratory,AirForceGeneralHospitalPLA)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of ALA-PDT on the proliferation and cell cycle of A431 cells. MethodsA431 cells were cultured and divided into two groups. The cultured cells were treated with ALA-PDT in one group(ALA-PDT group), and not treated in the other group(control group). The relative surface of argyrophilic protein in nucleolar organizer regions(AgNORs) was calculated after argyrophilic staining．Flow cytometry was applied to analyze the cell cycle and proliferation index(PI)．ResultsThe relative surface of AgNORs in A431 cells was reduced markedly after ALA-PDT treatment. The cell percentage in S stage was decreased to(9.2±2.1)% in ALA-PDT group, significantly lower than in control group. PI in ALA-PDT group was less than that in control group[(47.0±3.4)% vs (31.1±3.1)%,P<0.05].ConclusionALA-PDT can inhibit the proliferation of A431 cells and change cell cycle of A431 cells.

Key words:photodynamic therapy;epidermal squamous cell carcinoma;proliferation index;argyrophilic protein;cell cycle

[收稿日期：2015-07-10]

作者简介：乔丽，女，1979-01生，博士，主治医师，E-mail：winhp2006@163.com.

中图分类号：R730.261

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)01-0051-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.012