地毯草种质资源ISSR标记遗传多样性分析

廖 丽，王晓丽，刘建秀，刘 洋，白昌军，徐毓皎，张欣怡，王志勇

(1.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 海南大学农学院，海南 海口 570228；2.江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014； 3.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737)



地毯草种质资源ISSR标记遗传多样性分析

廖 丽1，王晓丽1，刘建秀2，刘 洋1，白昌军3，徐毓皎1，张欣怡1，王志勇1

(1.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 海南大学农学院，海南 海口 570228；2.江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014； 3.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737)

摘要：地毯草(Axonopus compressus)是华南地区使用的多年生草本植物，本研究通过ISSR标记对华南地区64份地毯草种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行分析。结果表明，25对ISSR引物共扩增出208条清晰谱带，大小在300～1 500 bp，其中多态性条带有196条，多态性比率为94.23%，25对引物扩增条带数在4～15条，平均每对引物8.32条，遗传相似系数是0.46～0.99。通过UPGMA方法对64份地毯草材料进行聚类分析。结果表明，来自相同采集地区的材料并没有完全聚在一类，供试材料间出现较大的遗传差异。本研究结果可为今后开展地毯草种质资源遗传保护、品种鉴定、新品种选育提供基础。

关键词：地毯草；种质资源；ISSR；遗传多样性

地毯草(Axonopuscompressus)，别名大叶油草，属禾本科地毯草属多年生草本植物，暖季型草坪草。其中地毯草属约有40个种，在我国主要分布在热带和亚热带等气候温暖湿润地区，但是地毯草不耐寒，气温变低时叶色就会呈现紫红色，植株枯黄，影响观赏价值和使用价值[1]。目前世界各国对地毯草种质资源的研究还只停留在一些简单的调查上, 还没有把性状的鉴定与控制性状的基因以及基因的传递和变异规律的研究结合起来，但在地毯草属的形态多样性[2-4]、抗逆性[5-9]、分子标记[10-11]等方面的研究较多。

目前，ISSR标记技术[12]具有操作简单、成本低、快速灵敏、多态性高、所需DNA 量少以及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有SSR 的稳定性。且ISSR标记技术已经广泛地应用于品种鉴定[13]、遗传多样性分析[14-17]等研究，然而，地毯草种质资源分子标记研究甚少[10-11,18]。席嘉宾等[19]利用15个野生地毯草品系建立了ISSR的反应体系并进行了遗传多样分析。本研究在此基础上，利用ISSR标记对国内外63份野生地毯草种质和1份育成品种的遗传多样性和亲缘关系进行研究，为今后地毯草种质开发利用提供基础。

1材料与方法

1.1试验材料

64份材料分别来源于中国的海南、广州、广西、云南、福建和贵州以及澳大利亚(表1)，种植在海南大学儋州校区农学院基地并统一管理。

1.2基因组DNA的提取和检测

地毯草基因组DNA的提取参照改良的CTAB法[20]，并做了适当的修改。取DNA原液5 μL，加入1 μL的上样缓冲液，混匀，然后用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测(其中电泳缓冲液为0.5×TBE，电压3～4 V·cm-1电泳30 min), 最后稀释成50 ng·μL-1备用。

1.3ISSR-PCR扩增体系

ISSR反应体系(20 μL)和扩增程序为[16,19]：2 μL 10 × buffer (100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.3,500 mmol·L-1KCl,15 mmol·L-1MgCl2)；1.8 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，1 μL 50 ng模板 DNA;1 μL 10 μmol·mL-1ISSR引物(表2);1 μL 5 U·μL-1Taq DNA聚合酶;无菌去离子水补至20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，45～55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共45 个循环；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.4ISSR-PCR扩增产物凝胶电泳检测

扩增结束后，取扩增产物8.5 μL与2 μL 6×Loading Buffer(TaKaRa)混匀，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，电压4 V·cm-1,时间1.5～2 h，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳结束后取出凝胶，在凝胶成像仪上检测照相，进行分析。

1.5数据处理与分析

根据ISSR扩增出来的电泳图谱进行人工读带，对电泳图谱上清晰可辨且可重复出现的条带记为“1”，无则记为“0”，从而生成原始数据矩阵，根据UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Means Cluster Analysis)法对数据进行遗传相似性聚类分析。遗传相似系数(GS)=2Nij/(Ni+Nj)，式中，Nj为第j个品种的扩增条带数目，Ni为第i个品种的扩增条带数,Nij代表第i、j个品种间共有的扩增条带数[21]。

2结果与分析

2.1ISSR标记对地毯草种质扩增的多态性分析

本研究按最佳反应程序及体系最终从ISSR 801到ISSR 900共100对引物中筛选出25对稳定性好、多态性高、条带清晰且重复性好的引物，用于64份地毯草种质的扩增。25对引物共扩增出208条条带清晰谱带，大小在300～1 500 bp，其中多态性条带有196条，单对引物扩增条带数在4～15条，平均每对引物8.32条，多态性比率为94.23%(表2)。引物ISSR 811扩增产物的多态性条带数为15条，其多态性最丰富，但是ISSR 856的扩增产物图谱最清晰(图1)。

2.2遗传相似性分析

相似系数是用来比较群体或个体间亲缘关系的远近程度,相似系数越高,则说明材料间亲缘关系越近,遗传背景一致性越强。64份地毯草种质遗传相似系数范围为0.46～0.99。遗传相似系数最高的是来自广西合浦的A107和A108品系，相似系数为0.99，表示亲缘关系最近；亲缘关系最远的是来自广东惠州的A54品系和广东遂溪的A126品系，其遗传相似系数为0.46，表明这些种质具有比较高的遗传多样性。

表1　供试材料

2.3ISSR标记的聚类分析

用UPGMA法对64份地毯草材料进行聚类分析(图2)，从绘出的树状聚类图可以看出，在遗传相似系数0.74处，将64份地毯草种质材料分为3类：第Ⅰ类由25个材料组成，分别来自海南(A2、A3、A4、A5、A7、A15、A16、A37、A30、A38、A102、A141)、福建(A57、A59、A81、A83、A84)、广东(A45、A58、A99)、广西(A82)、云南(A47、A63)、贵州(A49)和澳大利亚(A46)；第Ⅱ类也包括25个材料，分别来自海南(A19、A114、A139、A105)、福建(A51)、广东(A98、A113、A118、A116、A121、A123、A122、A126、A100)、广西(A94、A101、A106、A107、A108、A111、A120、A140)和云南(A72、A97、A95)；第Ⅲ类包括14份种质，分别来自海南(A23、A28、A34、A42、A103)、广东(A54)、广西(A52、A87、A88、A25)、云南(A41、A63、A67、A70)和福建(A86)，从聚类结果来看，来自相同采集地区的材料并没有完全聚在一类，供试材料间出现较大的遗传差异。

表2　ISSR分析所用的引物序列和扩增结果

3讨论与结论

由于ISSR标记具有较好的稳定性和多态性[13]。ISSR标记在研究植物遗传多样性方面被认为是一种非常有效的方法并具有很大的应用潜质[12,22-24]。在本研究中，通过ISSR标记分析了64份地毯草种质，显示出了丰富的多态性，这表明ISSR标记用于研究地毯草遗传多样性的可行性，这与席嘉宾等[19]对野生地毯草的研究结果一致。

在本研究中，25对ISSR引物共获得了196条多态性条带，多态性比率为94.23%；席嘉宾等[2]用优化的ISSR反应体系分析中国野生地毯草种质，得到的多态性比率为89.67%；Wang等[16]用ISSR标记分析狗牙根的遗传多样性，多态性比率为86.7%，以上结果都显示了ISSR标记具有丰富的遗传多样性。

图1　64份材料DNA用ISSR 856引物扩增图谱

图2　64份地毯草种质的ISSR聚类分析结果

从64份地毯草的聚类分析结果来看，具有相同或相近地理来源的材料被聚在了一类，但也有不同来源的材料被聚在一类。这种现象也出现在其它种类中[11,16-18,25]。出现这种现象的原因主要有以下4个方面：1)有相同地理来源的材料虽然来自相同的环境，但由于育种材料和选择方向的复杂性，可能会出现遗传差异比较大的类型，因此，相同地理来源的材料被归入不同的类群；2)受环境的影响，在长期适应环境的过程中物种也会出现性状趋同的现象，造成不同性状间的交叉；3)地毯草属于多倍体[20]，在决定遗传分化中起了重要作用[18]，因此，为了进一步了解不同地毯草种质间的关系，在本研究的基础上，还需进一步分析地毯草的倍性，因为倍性分布可能取决于环境的影响，或者基因型的进化和历史发展[26-28]。对狗牙根(Cynodondactylon)[29]和类地毯草(A.affinis)[18]遗传多样性和倍性的研究也得到了类似结果。4)地毯草是多年生禾本科草和异型杂交繁育体系，也可导致丰富的遗传变异[16,18]，另外，有大的生态隔离也是必要的，例如：琼州海峡就可导致海南省和其它省份间种质的高变异，这种地理分布可以显著影响一个物种的遗传多样性。

参考文献(References)

[1]席嘉宾,陈平,郑玉忠,杨中艺.中国地毯草野生种质资源调查.草业学报,2004,13(1):52-57.

Xi J B,Chen P,Zheng Y Z,Yang Z Y.An investigation ofAxonopuscompressusgermplasm resources in China.Acta Pratacultural Science,2004,13(1):52-57.(in Chinese)

[2]席嘉宾,陈平,刘长春，郑玉忠，杨中艺.中国地毯草野生种质资源的形态特征和生物学特性的变异研究.四川草原,2004(12):32-37.

Xi J B,Chen P,Liu C C,Zheng Y Z,Yang Z Y.Study on morphological and biological variation of different wild carpetgrass.Journal of Sichuan Grassland,2004(12):32-37.(in Chinese)

[3]廖丽,陈玉华,赵亚荣,王晓丽，白昌军，王志勇.地毯草种质资源形态多样性.草业科学,2015,32(2):248-257.

Liao L,Chen Y H,Zhao Y R,Wang X L,Bai C J,Wang Z Y.Morphology diversity ofAxonopuscompressusgermplasm.Pratacultural Science,2015,32(2):248-257.(in Chinese)

[4]廖丽,黄小辉,胡化广,白昌军，王志勇.地毯草种质资源耐盐性初步评价.草业科学,2012,29(5):704-709．

Liao L,Huang X H,Hu H G,Bai C J,Wang Z Y.Preliminary evaluation of salt tolerance ofAxonopuscompressus.Pratacultural Science,2012,29(5):704-709.(in Chinese)

[5]廖丽，黄小辉，白昌军，王志勇.地毯草对铝胁迫响应及临界浓度的研究.热带作物学报,2011,32(7):1235-1239.

Liao L,Huang X H,Bai C J,Wang Z Y.Study on responses ofAxonopuscompressus(Sw.) Beauv. to aluminum stress and critical aluminum concentration.Chinese Journal of Tropical Crops,2011,32(7):1235-1239.(in Chinese)

[6]Ma L,Kenworthy K E,Lu H J,Cherry R.Genetic variability of reproductive traits in common carpetgrass.Hortscience,2014,49(7):856-858.

[7]Smith M A,Whiteman P C.Evaluation of tropical grasses in increasing shade under coconut canopies.Agricultural Sciences,1983,19(2):153-161.

[8]张静，廖丽，白昌军,王志勇.地毯草耐铝性初步评价.草业科学,2012,29(11):1671-1677.

Zhang J,Liao L,Bai C J,Wang Z Y.Preliminary evaluation on aluminum tolerance ofAxonopuscompressus.Pratacultural Science,2012,29(11):1671-1677.(in Chinese)

[9]Uddin M K,Juraimi A S,Ismail M R.Growth response of eight tropical turfgrass species to salinity.African Journal of Biotechnology,2009,8(21):5799-5806.

[10]Wang X L,Li Y,Liao L,Zhang X Y,Bai C J,Wang Z Y.Isolation and characterization of microsatellite markers forAxonopuscompressus(Sw.) Beauv. (Poaceae) using 454 sequencing technology.Genetics and Molecular Research,2015,14(2):4696-4702.

[11]Wang X L,Liao L,Zhang X Y,Bai C J,Wang Z Y.Genetic diversity ofAxonopuscompressus(Sw.) Beauv. germplasm based on simple sequence repeat markers.HortScience,2015,50(6):797-800.

[12]Zieticwiez E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification.Genomics,1994,20(2):176-183.

[13]Fang D Q,Roose M L.Identification of closely related citreus cultivars with inter simple sequence repeat markers.Theoretical and Applied Genetics,1997,95(3):408-417.

[14]Femandez M E,Figueiras A M,Benlto C.The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism,genotype identification and genetic diversity among barley cultivars with known origin.Theoretical and Applied Genetics,2002,104(5):845-851.

[15]Joshi S P,Gupta V S,Aggarwal R K,Ranjekar P K,Brar D S.Genetic diversity and phlogenetic relationship as revealed by inter sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genusOryza.Theoretical and Applied Genetics,2000,100(8):1311-1320.

[16]Wang Z Y,Liao L,Yuan X J,Guo H,Guo A,Liu J X.Genetic diversity analysis ofCynodondactylon(bermudagrass) accessions and cultivars from different countries based on ISSR and SSR markers.Biochemical Systematics and Ecology,2013,46(2):108-115.

[17]黄文达,赵学勇,李玉霖,罗亚勇,王少昆,潘成臣.不同海拔梯度下小叶锦鸡儿的居群遗传多样性,草业科学，2015,32(4):552-559.

Huang W D,Zhao X Y,Li Y L,Luo Y Y,Wang S K,Pan C C.Genetic diversity analysis ofCaraganamicrophyllapopulation in different altitude gradients.Pratacultural Science,2015,32(4): 552-559.(in Chinese)

[18]Wang Z,Kenworthy K E,Wu Y Q.Genetic diversity of common carpetgrass revealed by amplified fragment length polymorphism markers.Crop Science,2010,50(4):1366-1374.

[19]席嘉宾，郑玉忠，杨中艺.地毯草ISSR反应体系的建立与优化.中山大学学报，2004，43(3): 57-61．

Xi J B,Zheng Y Z,Yang Z Y.Establishment and optimization of ISSR reaction system for carpetgrass.Acta Scientiarum Naturaliun Unversitatis Sunyatseni，2004,43(3):57-61.(in Chinese)

[20]Delay G.Nombres chromosomiques chez les Phanérogames.Revue de Cytologie et de Cytophysiologie Végétales,1951,12:361-368.

[21]Nei M,Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases.Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,1979,76(10):5269-5273.

[22]Provan J,Powell W,Waugh R.Analysis of cultivated potato (Solanumtuberosum) using inter-microsatellite amplification.Genome,1996,39(4):767-779.

[23]Hodkinson T R,Chase S A,Renvoize M W.Characterization of a genetic resource collection forMiscanthus(Saccharinae, Andropogoneae Poaceae) using AFLP and ISSR-PCR.Annals of Botany,2002,89(5):627-636.

[24]Kojoma M,Iida O,Makino Y,Sekita S,Satake M. DNA flngerpdnting ofCannabissativausing inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification.Planta Medica,2002,68(1):60-63.

[25]Godwin I D,Aitken E A,Smith L W.Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to Plant genetics.Electrophoresis,1997,18(9):1524-1528.

[26]Johnson P G,Riordan T P,Arumuganathan K.Ploidy level determinations in buffalograss clones and populations.Crop Science,1998,38:478-482.

[27]Tang R T,Gao G Q,He L Q,Han Z Q,Shan S H,Zhang R C.Genetic diversity in cultivated groundnut based on SSR markers.Journal of Genetics and Genomics,2007,34(5):449-459.

[28]陈立强，师尚礼.42份紫花苜蓿种质资源遗传多样性的SSR分析.草业科学，2015,32(3)：372-381.

Chen L Q,Shi S L.Genetic diversity of 42 alfalfa accessions revealed by SSR markers.Pratacultural Science,2015,32(3):372-381.(in Chinese)

[29]Wu Y Q,Taliaferro C M,Bai G H,Martin D L,Anderson J A,Anderson M P,Edwards R M.Genetic analysis of ChineseCynodonaccessions by flow cytometry and AFLP markers.Crop Science,2006,46(2):917-926.

Corresponding:Wang Zhi-yongE-mail:wangzhiyong@hainu.edu.cn

Analysis of genetic diversity ofAxonopuscompressususing ISSR markers

Liao Li1, Wang Xiao-li1, Liu Jian-xiu2, Liu Yang1, Bai Chang-Jun3,Xu Yu-jiao1, Zhang Xin-yi1,Wang Zhi-yong1

(1.Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources,Ministry of Education, College of Agronomy Hainan University, Haikou 570228, China;2.Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China;3.Tropical Pasture Research Center,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China)

Abstract:Axonopus compressus is perennial herbaceous plants and used in south China. Genetic diversity of 64 carpetgrass accessions (cultivar) was analyzed using the ISSR markers. The results showed that 25 ISSR primers generated 208 distinct bands (300～1 500 bp), 196 (94.23%) of which were polymorphic bands. The number of observed bands ranged from 4 to 15, with average of 8.3. The genetic similarity coefficient is between 0.46～0.99. Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) clustered 64 accessions (cultivar) into three groups, and not all samples from the same region belonged to the same group. ISSR markers has potential in marker-assisted breeding and the assessment of genetic diversity in wild germplasm resources of carpetgrass.

Key words:Axonopus compressus; germplasm; ISSR; genetic diversity

中图分类号：S540.3

文献标识码：A

文章编号：1001-0629(2016)4-0608-07*

通信作者：王志勇(1979-)，男，江西乐平人，副教授，博士，研究方向为热带草坪草种质资源遗传多样性与遗传育种。E-mail:wangzhiyong@hainu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金项目(31060266)；海南省自然科学基金项目(310031)

收稿日期：2015-08-24接受日期：2015-12-08

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0472

廖丽,王晓丽,刘建秀,刘洋,白昌军,徐毓皎,张欣怡,王志勇.地毯草种质资源ISSR标记遗传多样性分析.草业科学,2016,33(4)：608-614.

Liao L,Wang X L,Liu J X,Liu Y,Bai C J,Xu Y J,Zhang X Y,Wang Z Y.Analysis of genetic diversity ofAxonopuscompressususing ISSR markers.Pratacultural Science，2016,33(4)：608-614.

第一作者：廖丽(1981-)，女，江西乐安人，副教授，博士，研究方向为植物种质资源遗传多样性与质量评价。E-mail:liaoli@hainu.edu.cn