Twist蛋白在结直肠癌中的表达水平及其促进癌症发展的机制研究

王琳

（河南省郑州人民医院放疗科，河南郑州450000）



Twist蛋白在结直肠癌中的表达水平及其促进癌症发展的机制研究

王琳

（河南省郑州人民医院放疗科，河南郑州450000）

摘要：目的研究Twist蛋白在结直肠癌中的表达水平，其对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭能力的影响，并探讨其促进癌症发展具体的机制。方法经结肠镜活检取20例患者组织和20例正常人的标本，采用实时定量PCR的方法检测了Twist的mRNA表达水平。采用脂质转染法对结直肠癌细胞系CT-26细胞进行RNA干扰，采用CCK-8法及transwell法观察干扰Twist后对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭能力的影响；采用RT-PCR以及Western blot检测了CT-26细胞中MMP-9的mRNA及蛋白水平。结果Twist在结直肠癌组织中的mRNA水平显著高于对应癌旁组织以及对照组（P<0.05）；在伴有淋巴结转移的癌组织中Twist mRNA的表达水平显著高于无淋巴结转移的组织（P<0.05）；与转染对照组比较，Twist siRNA转染的CT-26细胞增殖水平及迁徙能力均显著降低（P<0.05）；干扰Twist的CT-26细胞能够显著降低金属蛋白酶MMP-9 mRNA及蛋白的水平。结论Twist蛋白能够增加结直肠癌癌细胞的增殖及迁徙能力，其影响机制可能与金属蛋白酶MMP-9有关。

关键词：Twist蛋白；结直肠癌；MMP-9；增殖；侵袭；机制

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，目前，我国结直肠癌的发病率居第3位，其病死率居第4位，且该病的患者群逐渐趋向年轻化[1]。因此，深入探讨结直肠癌发病及转移的分子机制，寻找新的治疗靶点，对治疗结直肠癌具有重要的意义。Twist蛋白是碱性螺旋-环-螺旋家族的转录因子之一，已有大量的研究表明，其在促进上皮-间质转变，参与实体肿瘤的远处器官转移及癌旁结节形成中发挥重要的作用[2-5]。国外学者Valdés-Mor等发现，Twist过度表达与男性原发性大肠癌的淋巴结浸润密切相关[6]，然而至今，结直肠癌癌患者中Twist的表达水平以及其对结直肠癌癌细胞的增殖及迁移影响的研究尚无报道。因此，本研究旨在探讨Twist在结直肠癌组织中的表达情况，并从体外通过低表达结直肠癌细胞系中的Twist水平来探讨其影响结直肠癌迁移的分子机制。

1　资料与方法

1.1临床资料

所有结直肠癌组织来源于2013年8月-2014 年1月来郑州人民医院就医患者的手术切除标本。癌变组共20例，其中，男性11例，女性9例；年龄57～73岁，平均（62.2±6.6）岁。所有组织标本经术后病理学证实为结直肠癌，分别取结直肠癌及对应肿瘤边缘2～6 cm处癌旁组织进实验分析。对照组取同期医院检查的正常20例人群结直肠黏膜组织，其中，男性12例，女性8例，年龄60～72岁，平均（63.52±7.53）岁。

1.2结直肠癌组织以及血浆标本总RNA提取及逆转录反应（PT-PCR）

取结直肠癌及对应癌旁组织约100 mg组织后，加入1 ml的Trizol（美国Invitrogen公司）充分匀浆，将抽提的总RNA溶于30μl DEPC水溶液。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量分析，并采用Femantes逆转录试剂盒进行逆转录，cDNA产物-20℃冰箱保存备用。荧光定量PCR试剂盒购自美国Roche公司，本实验使用美国ABI公司的7300型号Real-Time PCR仪器进行扩增，PCR反应条件：95℃变性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s进行40个循环，使用2-ΔΔCt法进行相对定量分析结果。RT-PCR序列：基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）：正向引物：CGCAGACATCGTCATCCAGT，反向引物：GGATTGGCCTTGGAAGATGA；Twist：正向引物：CACGCAGTCGCTGAACGA，反向引物：GACCTGGTACAGGAAGTCGATGT；GAPDH：正向引物：AACTGGGACGACATGGAGAA，反向引物：ATACCCCTCGTAGATGGGCA。

1.3细胞转染

小鼠大肠癌细胞CT-26细胞采用完全DMEM培养液培养，待汇合度达到50%～60%左右。采用脂质体Lipofectamine®2000（美国Invitrogen公司）对小鼠大肠癌细胞CT-26细胞中Twist进行小RNA干扰，Twist的siRNA靶向序列为5'-GGUACAUCGACUUCCUGUATT；对照序列为5'-UCAUAAGUG AUGCUGGAGCTT[7]。待干扰48 h后，采用RT-PCR技术验证转染效率。

1.4细胞迁移实验

取对数生长期的结肠癌细胞并调整细胞密度至2×105～3×105个/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上层，小室下层加入l ml的10%血清的培养液。培养24 h时间后，对已迁移至小室下层的细胞进行计数（×200倍）。

1.5CCK-8试剂检测细胞增殖

按CCK-8试剂（上海前尘生物科技有限公司）说明书进行分析。分别收集未处理组和转染组的24 h，48 h和72 h后的CT-26细胞，加入终浓度为10%的CCK-8试剂，于37℃培养箱中继续孵育3 h，然后测定450 nm的光密度（optical density，OD）值。

1.6免疫印迹法（Western blot）检测蛋白水平

细胞收取后，加入1×SDS细胞裂解液，进行SDS-PAGE电泳，110 V电压转膜100 min，37℃封闭后，加兔抗人的MMP-9（美国Biolegend公司）4℃孵育过夜后，HRP标记的小鼠抗兔二抗（南京生兴生物公司）（1∶1 000稀释）37℃孵育50 min，内参蛋白选用美国Sigma公司的抗人β-actin（1∶5 000稀释），孵育后用PBS-T洗膜3次，进行免疫印迹化学发光（ECL）检测。

1.7统计学方法

所有数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，均通过正态性检验。两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较为单因素方差分析＋两两多重比较（LSD-t检验）。多时点资料的比较则为单因素重复测量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1结直肠癌组织及对应癌旁中Twist mRNA表达水平

3组的Twist mRNA表达水平，整体比较差异有统计学意义（F=128.590，P=0.000）。与正常组织比较，结直肠癌癌旁组织中Twist mRNA水平显著增高，差异有统计学意义（t =4.547，P=0.000）；与癌旁组织比较，结直肠癌组织中Twist mRNA的表达水平显著增高，差异有统计学意义（t =11.045，P = 0.000），见表1。

表1　结直肠癌及对应癌旁组织中Twist mRNA表达水平（n=20，±s）

表1　结直肠癌及对应癌旁组织中Twist mRNA表达水平（n=20，±s）

组别　TwistmRNA　F值　P值A：正常组织　1.24±0.41 B：癌旁组织　2.41±0.57　128.590　0.000 C：结直肠癌组织　5.25±1.22 A VS C（t值，P值）　4.547，0.000 B VS C（t值，P值）　11.045，0.000

图1　低表达Twist对结直肠癌细胞增殖及侵袭的影响

表2　低表达Twist对结直肠癌细胞增殖及侵袭的影响（n=6，±s）

表2　低表达Twist对结直肠癌细胞增殖及侵袭的影响（n=6，±s）

注：整体比较为单因素方差分析，两两比较为LSD检验

组别　TwistmRNA　OD450 nm　　细胞数0 h　24 h　48 h　72 h A：空白组　1.03±0.18　1.12±0.06　1.41±0.11　2.27±0.16　5.92±0.18　34.0±2.6 B：对照组　0.98±0.19　1.14±0.06　1.52±0.17　2.52±0.51　6.18±0.61　32.6±4.6 C：siRNA组　0.35±0.06　1.09±0.05　1.20±0.16　1.83±0.40　3.25±0.41　18.9±1.8 F值P值35.556 0.000 1.213 0.325 7.136 0.007 4.848 0.024 82.439 0.000 35.556 0.000 A VS B（LSD-t值，P值）　0.588，0.565　0.474，0.642　1.269，0.224　1.148，0.269　1.013，0.327　0.588，0.565 A VS C（LSD-t值，P值）　7.579，0.000　1.048，0.311　2.448，0.027　1.932，0.072　10.579，0.000　7.579，0.000 B VS C（LSD-t值，P值）　6.991，0.000　1.522，0.149　3.716，0.002　3.081，0.008　11.592，0.000　6.991，0.000

2.2Twist mRNA表达与淋巴结转移及Duckes分期的关系

所有患者中，无淋巴结转移8例（Dukes A/B期），而具有淋巴结转移12例（Dukes C/D期）。Twist mRNA的表达水平在Dukes C/D期组织中的表达水平为（3.01±0.51），显著高于Dukes A/B期的（1.29±0.31），差异具有统计学意义（t =8.505，P= 0.000）。

2.3siRNA干扰Twist对CT-26细胞的增殖及侵袭功能的影响

经CT-26细胞转染后，3组Twist siRNA水平，24 h后450 nm的OD值及5视野的细胞计数整体比较差异均有统计学意义（P<0.05）。CT-26细胞转染Twist siRNA后，Twist mRNA水平与对照组比较显著降低（P<0.05），见图1A；CCK-8法结果显示，与对照组比较，CT-26细胞干扰Twist基因72 h后的增殖能力显著降低（P <0.05），见图1B；进一步实验结果显示，CT-26细胞转染Twist siRNA后，transwell小室下层细胞数量与对照组比较显著减少（P< 0.05），见图1C。此外，对转染Twist siRNA后的CT26细胞的CCK-8法检测结果，进行多时间点重复测量分析发现，各时间点间差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4CT-26细胞干扰Twist对MMP-9的mRNA和蛋白表达影响

3组的MMP-9 mRNA表达水平，整体比较差异有统计学意义（F=39.381，P=0.000）。与对照组比较，干扰Twist的CT-26细胞能显著降低MMP-9 mRNA的水平，差异有统计学意义（t =7.365，P = 0.000），见表3，图2A；并能显著降低MMP-9蛋白的水平，见图2B。

表3　低表达Twist对CT-26细胞迁徙基因MMP-9 mRNA及蛋白水平影响（n=6，±s）

表3　低表达Twist对CT-26细胞迁徙基因MMP-9 mRNA及蛋白水平影响（n=6，±s）

注：整体比较为单因素方差分析，两两比较为LSD检验；†与对照组比较，t=7.365，P=0.000

组别　MMP-9 mRNA　F值　P值空白组　1.14±0.22对照组　1.02±0.20　39.381　0.000 siRNA组　0.31±0.04†

图2　低表达Twist对CT-26细胞迁徙基因MMP-9 mRNA及蛋白水平影响

3　讨论

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，且近年来，全世界结直肠癌的发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势[8]。因此，研究结直肠癌发病的细胞学及分子学机制对其预防和治疗有着极大的临床意义。Twist是一种最早在果蝇的受精卵中被发现的基因，由于果蝇胚胎Twist基因缺失后的发育呈一种“扭曲”的现象，表现为原肠胚形成受阻、中胚层发育障碍而导致胚胎发育的末期死亡，从而将该基因命名为“Twist”[9]。近年来，越来越多的研究认为Twist基因参与上皮-间质转变过程中的调控，其在卵巢癌、胰腺癌等肿瘤细胞发生及其侵袭和转移中均发挥十分重要的功能[10-12]。然而目前，Twist在结直肠癌中的表达水平以及其对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭能力的影响机制尚不完全明了。

本研究发现，Twist在结直肠癌癌组织以及癌旁组织中mRNA水平显著高于正常黏膜组织，且癌组织中表达更高；此外，Twist在伴有淋巴结转移的癌组织中其表达水平高于无淋巴结转移的癌组织，说明Twist具有潜在的促进结肠癌的发病以及对结肠癌的转移有着一定的促进功能。这与Sasaki等人研究的在人食管鳞状细胞癌中Twist高表达，并参与癌症转移结果一致[5]。为了进一步观察Twist对结直肠癌癌细胞的增殖及迁移能力的影响，笔者通过siRNA干扰技术对结直肠癌癌细胞系CT-26细胞系低表达Twist。结果发现，结直肠癌癌细胞Twist低表达后，癌细胞的增殖及侵袭能力也相应降低，提示了Twist对结肠癌的细胞增殖以及转移具有重要的促进作用。恶性肿瘤发生浸润转移重要的步骤之一是肿瘤细胞对基质的降解，而MMP-9已被证实参与多种肿瘤的浸润转移[13-15]。为了进一步探讨Twist影响结直肠癌癌细胞迁移的机制，笔者检测了siRNA干扰Twist水平后的MMP-9的表达，结果发现Twist低表达后能够显著抑制MMP-9的表达水平，从而提示Twist可能通过促进MMP-9的表达来增加癌细胞迁移能力，这与Li等在人腹膜间皮细胞中高表达Twist后可以增加细胞的迁移能力的结果一致[16]。

综上所述，Twist可能通过促进MMP-9的表达增加癌症的迁移，其在结直肠癌的发生、发展中发挥着及其重要的作用。临床中Twist的检测对结肠癌的诊断及预后可能具有一定的指导意义。

参考文献：

[1]赵亮,丁彦青.结直肠癌转移机制研究进展[J].浙江大学学报:医学版, 2014, 43(4): 486-493.

[2] Qin Q, Xu Y, He T, et al. Normal and disease-related biological functions of Twist1 and underlying molecular mechanisms[J]. CellRes, 2012, 22(1): 90-106.

[3] Yang MH, Chen CL, Chau GY, et al. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2009, 50(5): 1464-1474.

[4] Zhang Z, Xie D, Li X, et al. Significance of TWIST expression and its association with E-cadherin in bladder cancer[J]. Hum Pathol, 2007, 38(4): 598-606.

[5] Sasaki K, Natsugoe S, Ishigami S, et al. Significance of Twist expression and its association with E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2009, 28: 158.

[6] Valdés-Mora F, G仵mez del Pulgar T, Bandrés E, et al. TWIST1 overexpression is associated with nodal invasion and male sex in primary colorectal cancer[J]. Annals of Surgical Oncology, 2009, 16(1): 78-87.

[7] Yu W, Kamara H, Svoboda KK. The role of twist during palate development[J]. Dev Dyn, 2008, 237(10): 2716-2725.

[8] Brenner H, Kloor M, Pox CP. Colorectal cancer[J]. Lancet, 2014, 383(9927): 1490-1502.

[9] Simpson P. Maternal-Zygotic gene interactions during formation of the dorsoventral pattern in drosophila embryos[J]. Genetics, 1983, 105(3): 615-632.

[10] Roesch A. TWIST and switch' metastasis [J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2014, 27(2): 157-158.

[11] Wang T, Li Y, Tuerhanjiang A, et al. Correlation of Twist upregulation and senescence bypass during the progression and metastasis of cervical cancer[J]. Front Med, 2014, 8(1): 106-112.

[12] Nuti SV, Mor G, Li P, et al. TWIST and ovarian cancer stem cells: implications for chemoresistance and metastasis[J]. Oncotarget, 2014, 5(17): 7260-7271.

[13] Xu C, Hu DM, Zhu Q. eEF1A2 promotes cell migration, invasion and metastasis in pancreatic cancer by upregulating MMP-9 expression through Akt activation[J]. Clin Exp Metastasis, 2013, 30(7): 933-944.

[14] Li X, Yang Z, Song W, et al. Overexpression of Bmi-1 contributes to the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by increasing the expression of matrix metalloproteinase (MMP)2, MMP-9 and vascular endothelial growth factor via the PTEN/PI3K/Akt pathway[J]. Int J Oncol, 2013, 43: 793-802.

[15] Hsin CH, Wu BC, Chuang CY, et al. Selaginella tamariscina extract suppresses TPA-induced invasion and metastasis through inhibition of MMP-9 in human nasopharyngeal carcinoma HONE-1 cells [J]. BMC Complement Altern Med, 2013, 13: 234.

[16] Li C, Ren Y, Jia X, et al. Twist overexpression promoted epithelial-to-mesenchymal transition of human peritoneal mesothelial cells under high glucose[J]. Nephrol Dial Transplant, 2012, 27: 4119-4124.

（张蕾编辑）

论著

Expression of Twist protein in colorectal cancer and mechanism of its cancer promoting effect

Lin Wang
(Department of Radiotherapy, Zhengzhou People's Hospital, Zhengzhou, Henan 450000, China)

Abstract:Objective To explore the expression of Twist protein in colorectal cancer and its impact on the proliferation and invasion of colorectal cancer cells, and to clarify the mechanism of its cancer promoting effect. Methods Twenty tissue specimens were selected from colorectal cancer patients and normal people through colonoscopy biopsy, respectively, then the expression of Twist mRNA was detected through real time quantitative PCR method. The colorectal cancer cell line CT-26 cell was RNA interfered by lipid transfection method, and was observed the impact of Twist after interference on the proliferation and invasion of colorectal cancer cells by CCK-8 method and transwell method, and the expression of mRNA and protein of MMP-9 in CT-26 cell were detected by RT-PCR and Western blot method. Results The expression of Twist mRNA in colorectal cancer tissues was significantly higher than in para-carcinoma tissues the control group (P< 0.05). The expression of Twist mRNA in colorectal cancer tissues with lymph node metastasis was significantly higher than in colorectal cancer tissues without lymph node metastasis (P< 0.05). Compared with transfection control group, the proliferation and migration ability of CT-26 cells transfected by Twist siRNA were significantly decreased (P < 0.05). CT-26 cells interfering Twist reduced the expression of mRNA and protein of metal protease MMP-9. Conclusions Twist protein strengthens the proliferation and migration ability of colorectal cancer cells, and the mechanism may relate with metal protease MMP-9.

Keywords:twist protein; colorectal cancer; MMP-9; proliferation; invasion; mechanism

收稿日期：2015-11-06

文章编号：1005-8982（2016）08-0028-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.006

中图分类号：R735.3

文献标识码：A