决明子调脂作用的代谢组学研究*

邓楠，余胜，刘文，戴迎春，张惠

（湖南省人民医院药学部，湖南长沙410005）



决明子调脂作用的代谢组学研究*

邓楠，余胜，刘文，戴迎春，张惠

（湖南省人民医院药学部，湖南长沙410005）

摘要：目的运用代谢组学方法考察决明子水提物对高脂血症大鼠血液内源性代谢物的影响。方法建立高脂血症大鼠模型，采用决明子水提物灌胃治疗，利用主成分分析法和偏最小二乘-判别分析对空白对照组、模型组及治疗组大鼠血液进行代谢组学分析。观察3组代谢轮廓差异并寻找生物标志物。结果利用主成分分析法和偏最小二乘-判别分析能将样本分开，谱库分析得到9种生物标志物：L-缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富马酸、异亮氨酸、丝氨酸、硬脂酸、亚油酸和胆固醇。结论基于气相色谱-质谱联用仪的代谢组学可以很好的从内源性代谢物的变化过程反应决明子水提物对大鼠的调脂作用。

关键词：高脂血症；决明子；代谢组学；模式识别

高脂血症是指由于体内脂质代谢紊乱而使得血浆脂质中一种或多种脂质的浓度超过正常值的一种病症。常因危害重要器官或组织而引起严重后果，如冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑血管意外等，是导致动脉粥样硬化的独立危害因素。目前临床上应用最为广泛的调脂药物包括各种他汀类药物，如辛伐他汀和洛伐他汀等，他汀类药物治疗高血脂症的同时可预防心脑血管意外事件[1]。但长期或大剂量使用他汀类药物可能会导致肝脏组织细胞生物化学变化或心脏横纹肌溶解等严重不良反应[2-4]。

因此，研究和开发安全、有效的新型降血脂药物具有重要的社会效益和经济效益。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门关于生物体系内源代谢物质种类、数量及其变化规律的科学[5]。近年来，代谢组学已被成功的应用于高脂血症的研究，为高脂血症的诊断和治疗提供了有效帮助[6-8]。

决明子作为一种常见的中草药材，长期临床应用表明，其降脂作用明确，疗效可靠，副作用少，但与其他传统中药一样，存在着成分复杂、机制不十分清楚等缺点[9-10]。在前人的基础上，本研究运用代谢组学方法探讨决明子水提物对高脂血症的逆转程度及调控作用，阐明决明子调脂作用的代谢物途径，为传统中药提供药效学理论依据。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

Beckman AU5821全自动生化分析仪（美国贝克曼公司），总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白-胆固醇（low-density lipoprotein，LDL-c）、高密度脂蛋白-胆固醇（high-density lipoproteins，HDL-c）测定试剂盒（北京九强生物技术有限公司提供），WH-2微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司），TGL-16低温高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），岛津GCMS-QP2010气质谱联用色谱仪（日本Shimadzu公司），岛津DB-5熔融石英毛细管柱（30 m ×0.25 mm×0.25μm，日本Shimadzu公司）。

胆固醇（北京乐博生物科技有限公司），胆盐、蛋黄粉（北京奥博星生物技术有限责任公司），甲硫氧嘧啶（天津市博迪化工有限公司），决明子（源和堂中药饮片公司，经湖南省人民医院药剂科汪洋主管中药师鉴定为豆科植物决明Cassia Obtusifolia L.的干燥成熟种子），2-异丙基苹果酸（美国Sigma公司）。

1.2实验动物

SD雄性大鼠36只，体重（200±20）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK（湘）2013-0004]。

1.3实验方法

1.3.1决明子水提液的制备取决明子100 g置于宜煎容器中，加蒸馏水250 ml浸泡0.5 h，加热煮沸，再小火持续加热0.5 h，滤取药液，残渣加水250 ml同法煎煮，重复2次，合并3次煎出液，置于50℃水浴锅中浓缩定容至250 ml，制成生药含量0.4 g/ml的决明子水提物，置4℃冰箱中保存备用。

1.3.2高脂血症大鼠模型制备及样品的采集与制备适应环境3 d后将大鼠随机分成2组，正常对照组（12只）：普通饲料喂养；高脂血症模型组（24只）：高脂饲料（蛋黄粉7%、猪油7%、胆固醇4%、胆酸钠0.4%、丙硫氧嘧啶0.3%及基础饲料81.3%）喂养。30 d后眼底静脉丛取血检测其生化指标，确认造模效果。造模过程中高脂血症模型组死亡3只，将余下的21只随机分成2组，分别为模型组（10只）和决明子组（11只）。决明子剂量按60 kg成人常用量的10倍计算，决明子组灌胃决明子水提液2 ml，相当于生药0.8 g，约2 g/（kg·d），正常组和模型组则给予等量安慰剂（羧甲基纤维素钠）。治疗30 d后眼底静脉丛取血，离心10 min（4℃，12 000 r/min），取血浆置于-80℃下保存，用于生化指标及气相色谱-质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometercomputer，GC-MS）检测。

1.4生化指标分析

取100μl血浆样本，利用Beckman AU5821全自动生化分析仪检测TC、TG、LDL-c及HDL-c。相关操作步骤参考试剂盒使用说明书。

1.5样品预处理与GC-MS分析

取血样室温解冻，取100μl血浆样本，加入10μl 2-异丙基苹果酸/甲醇溶液（内标，1 mg/ml），涡旋20 s，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋20 s，离心15 min（4℃，12 000 r/min），取上清液置于玻璃离心管，常温下氮气吹干，加入50μl甲氧胺吡啶溶液（15 mg/ml），涡旋45 s，70℃水浴肟化1 h，加入100μl硅烷化试剂N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺[bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA，内含1% TMCS]，涡旋15 s，70℃水浴1 h，冷却至室温，进样量1μl进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件：进样口温度280℃，初始柱温：70℃，保持4 min，以8℃/min速度升温至300℃，保持3 min；接口温度：250℃；离子源温度：200℃；氦气作为载气，流速1 ml/min，分流比10∶1，全扫描：35～850 m/z；溶剂切除时间：6.5 min。

1.6统计学方法

生化指标结果采用SPSS 13.0统计软件进行统计，数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，使用岛津色谱工作站对GC-MS总离子流图中各种代谢物的峰面积进行积分，利用NIST107和NIST05数据库对血浆中的代谢物进行鉴定，以相对峰面积（与内标峰的比值）表示代谢物的含量，得到GC-MS数据。各组灌胃给药前后的代谢物谱数据利用主成分分析法（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA）算法处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1生化指标分析

附表列出了造模前后的比较，正常组造模前后TC、LDL-c变化不明显（P>0.05），模型组造模前后TC与LDL-c显著升高（P<0.01），表明造模成功。

2.2GC-MS数据分析

大鼠血浆GC-MS总离子流（total ion-current，TIC）图，构成生物代谢物谱，如图1所示。鉴定结果，大鼠血浆中有48种内源性代谢物。

2.3多元统计分析

2.3.1PCA结果PCA是一种经典的无监督代谢组学分析方法，常用于样本分类的初步分析。运用SIMCA-P 11.0软件对大鼠血浆中所有的内源性代谢物进行PCA分析，结果如图2所示。可以看出，正常组和高脂组可以达到分离，决明子组与模型组有分开的趋势且接近正常组，表明决明子可以改善高脂血症大鼠状况。然而样本分离效果不佳，且PCA对离群点敏感[11]，考虑选用更高要求的化学计量学模式识别方法。

2.3.2PLS-DA结果PLS-DA是代谢组学中常用的有监督的模式识别方法，相对于PCA，PLS-DA以预测均方误差为回归目标，使得预测结果的均方误差更小，更具可靠性[12]。运用SIMCA-P 11.0软件对大鼠血浆内源性代谢物进行PLS-DA分析，结果如图3所示。可以看到正常组与模型组在第1、2主成分空间中得到了完全分离，决明子组向正常组靠近，证明橙黄决明素具有较佳的调脂效果。

附表　大鼠造模前后血脂指标（mmol/L，±s）

附表　大鼠造模前后血脂指标（mmol/L，±s）

组别　TC　TG　HDL-c　LDL-c正常组（n=10）造模前　2.13±0.31 1.88±0.50 0.79±0.16 0.22±0.02造模后模型组（n=21）2.23±0.42　1.52±0.36　0.89±0.12　0.31±0.11造模前　2.09±0.29 2.17±0.68 0.71±0.15 0.20±0.03造模后　4.33±0.65 0.71±0.35 0.98±0.14 1.77±0.31

图1　大鼠血浆GC-MS总离子流图

2.3.3生物标志物的确定运用SIMCA-P 11.0软件进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），得到VIP值图如图4所示，从大到小排序所有检测的质谱数据，VIP值越大，说明该数据对区分该模型的贡献越大，选定为结构鉴定的对象。选取VIP>1.5且有统计学意义的变量（P<0.05）作为生物标志物的判断标准，根据它们精确分子量和串联质谱结果和质谱数据库进行质谱信息匹配，对可能的生物标志物进行鉴定，再辅以标准品进行验证。结果得到以下9种生物标志物：L-缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富马酸、异亮氨酸、丝氨酸、硬脂酸、亚油酸和胆固醇。高脂饲料造模的过程中，大鼠血浆中甘氨酸、丝氨酸、硬脂酸及胆固醇含量上升，丙氨酸、L-缬氨酸、异亮氨酸、富马酸及亚油酸则下降，与已有报道基本符合[7]。决明子治疗30 d后，相应的变化得到回调，证明决明子通过调整体内部分氨基酸及游离脂肪酸而起到调脂作用。

图2　大鼠血浆样本的PCA投影图

图3　大鼠血浆样本的PLS-DA投影图

图4　大鼠血浆样本的VIP值

3　讨论

决明子作为传统中药，其调脂作用显著。对比大鼠造模前后内源性代谢物的变化，得到潜在的生物标志物包括：L-缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富马酸、异亮氨酸、丝氨酸、硬脂酸、亚油酸和胆固醇。决明子水提物治疗30 d后，大鼠血浆中变化最明显的9种代谢物分别为：L-缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富马酸、异亮氨酸、丝氨酸、硬脂酸、苯丙氨酸和胆固醇，其中8种代谢物与得到的高脂血症生物标志物相同，变化均有回调趋势。证明了决明子作用于氨基酸及脂肪酸的代谢通路，能够达到较好的调脂作用。本研究利用基于GC-MS的代谢组学研究了决明子水提物治疗高脂血症大鼠血浆中代谢物的变化，多元统计分析从代谢物的水平证实了决明子可以较好地调节高脂血症大鼠的血脂，从而达到良好的降脂作用。

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（张蕾编辑）

论著

Metabonomic study on lipid regulative effect of Cassia*

Nan Deng, Sheng Yu, Wen Liu, Ying-chun Dai, Hui Zhang
(Department of Pharmacy, People's Hospital of Hunan, Changsha, Hunan 410005, China)

Abstract:Objective To study the influences of Cassia aqueous extract on endogenous metabolites of blood in rats with hyperlipemia by using metabonomic method. Methods The rats were fed on fat diet to induce hyperlipemia, then treated with cassia aqueous extract. We analyzed metabolic finger print data of rats' plasma in the control, model and treated group. The plasma samples underwent preparation, derivation and GC/MS analysis. Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) was performed to detect the metabolic profile difference between the three groups. Results Through the metabonomic research, 9 biomarkers were found, which were L-valine, alanine, glycine, fumaric acid, isoleucine, leucine, serine, stearic acid, oleic acid, linoleic acid and cholesterol. Conclusions Metabonomic study based on GC-MS shows a good recognition of the lipid regulating effect of cassia aqueous extract.

Keywords:hyperlipidemia; Cassia; metabonomic; pattern recognition

*基金项目：湖南省科学技术厅科技计划项目（No：2014TT2004）

收稿日期：2015-12-20

文章编号：1005-8982（2016）08-0007-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.002

中图分类号：R-332；R589.2

文献标识码：A