蒙药珍宝丸对视网膜缺血再灌注损伤中的影响及ICAM-1，Caspase-3的表达

敖其尔 乌仁图雅

(内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特 010010)

实验研究

蒙药珍宝丸对视网膜缺血再灌注损伤中的影响及ICAM-1，Caspase-3的表达

敖其尔 乌仁图雅*

(内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特 010010)

观察ICAM-1，caspase-3在RIR损伤中的表达及蒙药珍宝丸对其的影响并探讨其对RIR损伤中的保护作用。方法：用升高眼压的方法制作兔视网膜缺血模型，在不同时间观察95只家兔视网膜组织病理学改变及ICAM-1，caspase-3的表达。结果：模型组视网膜神经节细胞层，内核层细胞数减少，出现大量的水肿和空泡，内核层细胞排列紊乱。缺血再灌注后6h起改变明显，24h达到高峰72h水肿和空泡减少，视网膜明显变薄。珍宝丸组水肿和空泡现象较模型组轻，内核层和神经节细胞数较模型组多，视网膜较厚，细胞排列有序。ICAM-1，caspase-3的表达6h起明显，24h达到高峰，72h仍少量表达。珍宝丸治疗组各观察指标表达变化规律与缺血再灌注组基本一致，但均较缺血再灌注组明显下降。结论：1.RIR损伤中ICAM-1，caspase-3的表达增高。2.珍宝丸对RIR损伤中ICAM-1，caspase-3的表达有抑制作用。3.珍宝丸对RIR损伤有保护作用。

RIR损伤;珍宝丸;ICAM-1;caspase-3

珍宝丸又名额尔敦-乌日勒，是临床上常用的传统蒙药。有清陈热，祛黄水，护白脉等功能[1]。本方性凉，是蒙医在临床治疗脑神经系统疾病、心血管疾病和各种疑难病的常用药。珍宝丸以其组方主从关系严谨，用药量少，药力独到，疗效卓著的特点，具有“神药”之称[2]。 为探讨珍宝丸对视网膜缺血再灌注损伤中的作用及原理本实验对RIR损伤中ICAM-1，caspase-3表达进行研究。

1 材料与方法

1.1 动物与分组:健康成年无眼疾家兔95只，体重2.5～3kg，随机分为正常组(5只)、模型组(30只)、珍宝丸组(30只)、维生素E组(30只)。后三组根据缺血再关注时间分为1h、6h、12h、24h、48h、72h组，每组(5只)。

1.2 主要试剂和设备:蒙药珍宝丸由内蒙古蒙药股份有限公司提供。维他命E由浙江医药股份有限公司提供。ICAM-1免疫组化试剂盒，Caspase-3免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，Poly-L-Lysine粘片剂由北京来福试剂公司提供。SABC试剂盒由武汉博士德公司提供。OLYMPUS光学显微镜，显微摄像系统由日本生产。OPTONVIDAS图像分析仪由德国生产。YZ直接检眼镜由苏州医疗器械厂生产。

1.3 动物模型的制备:RIR组、珍宝丸组和VE组动物称重后采用20%乌拉坦5ml/kg从耳缘静脉输入，同时兔眼滴用1%的地卡因表面麻醉，复方托品酞胺散瞳。麻醉成功后固定于自制的固定板上，将连接生理盐水瓶输液管的7号针头刺入兔右眼前房，避免损伤虹膜及晶状体，然后升高输液瓶至与实验眼垂直距离150cm处，此高度在眼内形成110mmHg(14.46kpa)的眼内压，此压力接近兔的体循环收缩压[4]。能完全造成视网膜血流阻断，直接检眼镜下可见视网膜苍白水肿，眼底血流阻断；维持60分钟后缓慢降低生理盐水瓶至与家兔在同一水平，使视网膜恢复血液供应，留针1分钟，拔除穿刺针，结膜囊涂红霉素眼膏防止感染，分笼饲养。期间每日双眼滴氯霉素眼药水2次维持角膜湿润和防止感染。

1.4 给药方法:在造模前7天连续灌胃给药，珍宝丸组0.15g/kg和VE组100mg/kg(1次/日)。正常组和模型组给予等量生理盐水。再灌注期间也同样剂量给药。

1.5 试验方法

1.5.1 标本制作:分别于再灌注后1h、6h、12h、24h、48h、72h采用耳缘静脉空气栓塞法处死动物，立即摘除眼球，4%多聚甲醛中性缓冲液固定24h。流水冲洗24h，脱水，透明，包埋，连续切片(厚度4um)。常规HE染色，光镜下观察。

1.5.2 ICAM-1，caspase-3的免疫组化检测切片用SABC免疫组化法染色，按ICAM-1，caspase-3试剂盒使用说明书进行检测。图像分析系统观察拍照。

1.5.3 统计学分析:采用SPSS13.0软件进行统计学分析。测定结果以X±S表示。组间进行单因素方差分析并进行两两比较，组内各时段做随机区组设计的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜的ICAM-1的表达

正常组：视网膜中ICAM-1微量表达。

模型组：缺血再灌注6h始在视网膜神经纤维层，内外核层少量表达，12h表达明显升高，24h(图1)达到高峰，48h始表达下降，72h仍少量表达。

珍宝丸组：视网膜ICAM-1蛋白表达变化规律与模型组相似，平均表达量较RIR组少，各时段表达量较RIR组相同时段少。

VE组：各时段表达均较RIR组相同时段低，各个时段表达均较珍宝丸组高(表1)。

表1 视网膜缺血再灌注损伤后不同时段ICAM-1的表达变化(灰度，单位：um)

注：灰度值范围在0～255,0为最黑，255为最亮。各组与正常组、模型组、VE组、给药组有统计学意义的依次标为1、2、3、4.

2.2 视网膜的Caspase-3的表达

正常组：视网膜中Caspase-3微量表达。

模型组：缺血再灌注6h始在视网膜神经节细胞层，内核层，内网织层表达开始明显。 24h达到高峰(图2)。48h始表达下降，72h仍少量表达。

珍宝丸组：视网膜ICAM-1蛋白表达变化规律与模型组相似，平均表达量较RIR组少，除1h组各时段表达量较RIR组相同时段少。

VE组：除1h组各时段表达均较RIR组相同时段低，除1h组各个时段表达均较珍宝丸组高(见表2)。

表2 视网膜缺血再灌注损伤后不同时段Caspase-3的表达变化(灰度，单位：um)

注：灰度值范围在0～255,0为最黑，255为最亮。各组与正常组、模型组、VE组、给药组有统计学意义的依次标为1、2、3、4.

2.3 RIR损伤的组织病理学改变：模型组1h组视网膜神经纤维层和内丛状层出现轻度水肿，6h组水肿明显，少量空泡出现，神经节细胞减少。12h后水肿和空泡现象严重，神经节细胞进一步减少，排列稀疏。内外核层密度均降低，排列紊乱，出现核碎裂，溶解和坏死。72h视网膜明显变薄，水肿减轻，细胞数量稀少。珍宝丸组水肿和内外核层密度降低等现象轻且出现时间晚。节细胞排列较规整，数量也多于未治疗组。

3 结论

从上述结果中得出以下结论：ICAM-1，caspase-3在24h灰度最小，说明表达最强。损伤最严重。珍宝丸组的平均灰度高于模型组和VE组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明珍宝丸对ICAM-1，caspase-3的表达有抑制作用，对视网膜缺血再关注损伤有保护作用。

4 讨论

视网膜缺血再灌注损伤是眼科常见的病理学改变。如视网膜中央动脉阻塞、分支动脉阻塞、青光眼、缺血性视神经病变等, 均可造成视网膜组织的缺血。在血液再通后, 往往对视网膜造成更为严重的损伤。因此, 积极探寻各种保护视网膜再灌注损伤的治疗方法具有重要的临床意义[4]。目前的研究表明它是多种因素综合作用的结果,如氧自由基的损伤、微血管的损伤、白细胞的作用和钙超载等[5]。目前研究发现,视网膜缺血再灌注损伤中存在着神经细胞凋亡现象, 且凋亡是视网膜神经细胞丢失的重要因素之[6]。其中细胞间黏附分子-1(ICAM-1) 是在血管内皮细胞表达的免疫球蛋白家族成员之一。它可作为配基与白细胞表面的VFA-1 和MAC-1 分子结合,介导白细胞与血管壁内细胞的黏附及白细胞穿出血管壁,从而导致缺血再灌注组织的损伤[7]。凋亡蛋白酶(caspases)是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。目前已发现该蛋白酶家族至少有13个成员，caspase在凋亡中所起的主要作用是：灭活细胞凋亡的抑制物；水解细胞的蛋白质结构，导致细胞结体，形成凋亡小体：在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能[8]。其中caspase-3是哺乳类动物细胞凋亡的关键蛋白酶，是细胞进入凋亡程序的特异性标志物。一般认为它在细胞凋亡过程中是最重要的终末剪切酶,在细胞凋亡中起着不可替代的刽子手作用。[9]

蒙药珍宝丸又名额尔敦乌日勒，出自《秘诀增补篇》。是由珍珠、麝香、牛黄等珍贵药品组成的传统蒙药。主治白脉病，黑脉病，中风，痛风及各种顽症。药理试验证明此药具有扩张毛细血管，促进微循环，降低血黏度，促进血液流通，减慢心率，降低心脏耗氧率，提高缺氧耐受度，抗血小板凝集，抗血栓形成，恢复神经细胞损伤，抗脂肪酸过氧化，清除氧自由基等作用[10]。据报道蒙药珍宝丸具有明显改善急性血瘀症模型大鼠异常的血液流变学状态，明显抑制异常增高的血细胞聚集作用[11]。对氧自由基有很强的清除和抑制作用[12]。对脑缺血再灌注损伤也有保护作用[13]。

我们通过兔RIR模型中应用免疫组织化学方法检测了，caspase-3的表达变化。发现视网膜缺血再灌注后ICAM-1，caspase-3表达增加，缺血再灌注后6h开始表达明显，24h达高峰，48h后渐减少，至72h仍有表达。珍宝丸治疗组各观察指标表达变化规律与RIR组基本一致，但均较RIR组明显下降。本研究显示，在RIR损伤中珍宝丸能降低ICAM-1，caspase-3的表达，且在一定程度上能够减轻视网膜组织的损伤。但因具体机理十分复杂，阐述还远不够完善，尚待进一步研究。

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2016年6月20日收稿

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1006-6810(2016)10-0059-03