哇巴因对大鼠离体心功能作用的量-效关系

王海珍，史　娜，王耀军，王竹青，李盼盼，姜玉新，王　静，周萍萍，王海华

(皖南医学院　1.生理教研室；2．临床学院，安徽　芜湖　241002)

·基础医学·

哇巴因对大鼠离体心功能作用的量-效关系

王海珍1，史娜1，王耀军2，王竹青2，李盼盼2，姜玉新1，王静1，周萍萍1，王海华1

(皖南医学院1.生理教研室；2．临床学院，安徽芜湖241002)

【摘要】目的：观察不同浓度哇巴因(ouabain,OUA)对大鼠离体心功能的影响。方法：SD雄性大鼠随机分成7组(n=6)：正常组(NC组)，OUA 10-9mol/L组，OUA 10-8mol/L组，OUA 10-7mol/L组，OUA 10-6mol/L组，OUA 10-5mol/L组，OUA 10-4mol/L组。左心室插管检测各组大鼠离体心脏血流动力学指标：左室峰压(LVSP)、心率(HR)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)；观察各组大鼠的心律失常发生情况并进行心律失常评分；检测各组相同时间点的冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性，同时测定各组心肌组织中Na+-K+-ATP酶的活性，HE染色观察各组大鼠心肌形态学变化。结果：同NC组相比，OUA 10-9mol/L组大鼠心脏LVSP×HR和+dp/dtmax无明显差异(P>0.05)，OUA 10-8mol/L和10-7mol/L组大鼠心脏LVSP×HR和+dp/dtmax呈剂量升高而增强(P<0.05或P<0.01)；OUA 10-9mol/L、OUA 10-8mol/L组的Na+-K+-ATP酶的活性明显升高(P<0.05或P<0.01)；同NC组相比，OUA浓度在(10-6～10-4)mol/L时，OUA对各组大鼠的心功能呈剂量依赖性抑制作用(P<0.01)；各组大鼠的心律失常评分明显升高；各时间点心脏灌流液中LDH的活性亦明显升高，各组心肌组织Na+-K+-ATP酶活性均呈剂量依赖性降低(P<0.05或P<0.01)。结论：低浓度哇巴因[(10-9～10-7)mol/L]对大鼠离体心脏有强心作用，但随着哇巴因浓度的升高[(10-6～10-4) mol/L]，转为对心脏呈剂量依赖性抑制作用。

【关键词】哇巴因;离体心脏;大鼠;浓度依赖

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.02.002

钠泵又称Na+-K+-ATP酶(NKA),是一种膜结合蛋白，在维持细胞内外电化学梯度、细胞渗透压平衡和静息电位中起关键作用。Na+-K+-ATP酶[1]是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体。钠泵α亚单位存在哇巴因的结合位点，而β亚单位参与细胞间黏附作用。除了离子泵功能外，钠泵还具有细胞受体的功能，配体通过与它结合，激活细胞内多种信号转导通路，从而调节细胞的增殖、肥大、分化和存活以及肿瘤细胞凋亡等多种生理病理过程[2-3]。Na+-K+-ATP酶是目前所知哇巴因的唯一细胞膜表面受体,哇巴因可促进其内吞,加速酶降解，减少细胞内Na+-K+-ATP酶的总量。关于哇巴因对心脏的影响多是经过心肌细胞分离或是细胞培养来探讨，而在器官水平对大鼠心脏作用的研究较为少见。本实验拟通过离体心脏灌流标本，观察不同浓度的哇巴因对大鼠离体心功能的量-效关系，初步探讨其可能机制，为下一步实验提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物SD大鼠(240±20)g购自合肥蜀山实验动物中心，合格证号：SCXK(苏)2009-0001。

1.2主要药品试剂与仪器哇巴因为白色粉末，购自美国Sigma公司，将其溶解于无水乙醇中配成10-3mol/L的母液，-20 ℃避光保存以备用[4]；Medlab-U/8c生物信号采集系统和Langendorff离体心脏灌流装置(南京美易科技有限公司)；RM6240BD型信号采集系统(成都仪器厂)；UV-3200PCS可见紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；D3024R高速微量冷冻离心机；美国赛默飞Multiskan GO全自动酶标仪；乳酸脱氢酶(LDH)和Na+-K+-ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3Langendorff离体心脏灌流模型的制备大鼠称重，麻醉(25%乌拉坦，4 mL/kg，ip)，开胸取心脏，迅速放入0～4 ℃的Krerbs-Henseleit(K-H)液中，清洗残留血液，经主动脉逆行插管，悬挂于Langendorff灌注装置，充以95%O2和5%CO2饱和气体的K-H液恒温(37 ℃)、恒压(8.33 kPa)逆行灌注。

1.3.1实验分组SD雄性大鼠随机分为7组(n=6),NC组(正常K-H液灌流120 min);OUA(10-9～10-4)mol/L组[正常K-H液灌流30 min后给予含(10-9～10-4)mol/L OUA的K-H液灌流30 min，再给予正常K-H液灌流60 min]。

1.3.2血流动力学指标测定将左心室中充满生理盐水的乳胶小囊连接于多道生理记录仪上(Medlab-U/8c生物信号采集系统，南京美易科技有限公司)，连续观察 LVSP，+dp/dtmax，并记录HR。

1.3.3心律失常评分待心脏复跳后，用自制的接触电极沿心脏长轴方向垂直加压于心尖部，参考电极置于主动脉根部，引导出心肌细胞的动作电位，连接于RM6240系统，引导出心肌细胞的单相动作电位。在哇巴因灌流15 min期间，取各种心律失常之和做出评分，评分参考Cuertis和Walker等人的评分规则[5]。

1.3.4生化指标检测分别收集各组灌流后稳定点(0 min)、15 min、30 min、60 min、90 min的冠脉流出液，于-20 ℃冻存；各组心脏灌注结束点立即取出心脏，于预冷的生理盐水中冲去血渍，去除心房和心室。留取心尖部心肌组织，称取质量约0.2 g心室肌放入5 mL的小烧杯中，与预冷的匀浆介质(Tris 1.21 g/L，EDTA 37.23 mg/L，蔗糖34.2 g/L，再以200 mmol/L的HCl滴定至pH为7.4)1∶9配比。剪碎后倒入玻璃匀浆器中研磨成10%的混悬液，于普通离心机中3000 r/min离心10 min，取上清液放置-20 ℃保存[6]，以测定Na+-K+-ATP酶的活性：组织匀浆总蛋白含量测定采用BCA法，按说明配置好各种试剂，酶促反应后取上清液200 μL定磷，最后在660 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零比色。冠脉流出液中LDH的活力采用微量酶标仪法，按试剂盒要求依次加入各种试剂后，在波长450 nm处，酶标仪测定吸光度。

1.3.5组织形态学检测灌流结束后留取心肌，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，切片厚5 μm，进行HE染色，光学显微镜下进行组织形态学观察。

2结果

2.1大鼠心功能指标与NC组相比，低浓度的哇巴因强心作用主要表现为，OUA 10-9mol/L组LVSP×HR无明显差异，OUA 10-8mol/L、10-7mol/L组在哇巴因灌流期间及灌流结束后LVSP×HR明显升高(P<0.05或P<0.01)，且呈现出时间与浓度依赖性(图1A)；在给予哇巴因灌流前，各组大鼠的+dp/dtmax无明显差异(P>0.05)，哇巴因灌注期间及灌流结束后，+dp/dtmax明显升高(P<0.05或P<0.01，表1)；高浓度则表现为抑制作用，同NC组相比，OUA(10-6～10-4)mol/L组在灌流期间及灌流结束后LVSP×HR明显下降(P<0.01)，且呈现出时间与浓度依赖性(图1B);在给予哇巴因灌流前，各组大鼠的+dp/dtmax无明显差异(P>0.05)，哇巴因灌注之后，随着时间的延长，表现为+dp/dtmax明显降低，与NC组相比，具有显著差异(P<0.05 或P<0.01)(表1)。

A.NC组，OUA 10-9mol/L组，OUA 10-8mol/L组，OUA10-7mol/L组；B.NC组，OUA 10-6mol/L组，OUA10-5mol/L组，OUA10-4mol/L组；*P<0.05，**P<0.01vs.NC group。

组别+dp/dtmax/(mmHg/s)0min15min30min60min90minNC组1912.93±34.911898.46±50.231879.01±65.051741.63±48.251662.85±34.86OUA10-9mol/L组1893.65±19.221975.32±76.79*1963.38±98.60*1777.85±39.301701.75±29.95OUA10-8mol/L组1896.38±29.391979.07±57.85*2062.75±68.52**1829.95±43.03**1747.83±38.40**OUA10-7mol/L组1873.77±45.292013.53±55.70**2105.57±55.32**1869.85±44.57**1802.67±20.45**OUA10-6mol/L组1932.81±39.601640.13±72.67**1282.81±45.50**1357.13±36.08**1295.83±41.67**OUA10-5mol/L组1895.65±22.701285.50±19.89**1072.34±44.46**1157.65±39.67**1094.75±45.37**OUA10-4mol/L组1911.15±30.871103.86±43.60**801.96±62.68**721.66±32.06**654.05±39.65**F1.94256.38399.87677.73821.72P>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01

*P<0.05，**P<0.01vsNC group。

2.2哇巴因灌流期间心律失常评分在哇巴因灌注15 min期间，NC组心律失常评分为1.10±0.08，OUA(10-9～10-7)mol/L组的心律失常评分分别为1.05±0.13、1.00±0.14、1.03±0.13,同正常组相比，无明显差异(P>0.05);OUA(10-6～10-4)mol/L组的心律失常评分分别为2.95±0.13、3.68±0.15、4.33±0.13,与正常组相比,差异显著(P<0.01)。

2.3OUA对冠脉流出液中LDH活性的影响如表2所示，在稳定点时各组大鼠灌流液中LDH的活性无明显差异(P>0.05),经过哇巴因灌流30 min后，OUA(10-9～10-7) mol/L组LDH活性无明显改变(P>0.05)，而OUA(10-6～10-4)mol/L组LDH活性均明显升高，与NC组相比，具有显著差异(P<0.01)。经过60 min的正常K-H液灌流后，与正常组相比，OUA(10-6～10-4)mol/L组LDH活性仍明显升高(P<0.01)。

2.4形态学变化HE染色显示NC组与OUA(10-9～10-7)mol/L组均表现为肌纤维排列整齐、结构完整，心肌细胞形态正常，排列有序，未见明显肿胀和坏死，肌原纤维结构完整(图2A～D);同NC组相比OUA(10-6～10-4)mol/L组出现肌纤维断裂，心肌细胞间隙增宽，心肌细胞肥大、肿胀甚至坏死，且随着浓度的增高，病理改变更为显著(图2E～G)。

组别LDH/(U/L)0min15min30min60min90minNC组18.54±0.7619.63±0.4520.36±1.0621.33±0.9722.28±0.69OUA10-9mol/L组17.94±0.9219.40±0.6320.27±0.7421.25±1.1622.79±0.53OUA10-8mol/L组17.88±0.7819.02±0.3819.97±0.7920.65±1.1722.58±0.50OUA10-7mol/L组18.35±0.8719.04±0.3921.01±0.5420.58±0.9623.01±0.74OUA10-6mol/L组18.23±0.9724.60±0.65**38.30±1.05**33.07±0.99**31.88±0.93**OUA10-5mol/L组19.31±0.8931.58±0.75**50.11±1.32**45.06±1.71**43.71±1.86**OUA10-4mol/L组17.84±0.6639.26±0.58**67.49±1.10**71.64±1.55**80.27±1.25**F2.251190.742261.811430.832587.24P>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01

*P<0.05，**P<0.01vsNC group。

A.NC组，B.OU A10-9mol/L组，C.OUA 10-8mol/L组，D.OUA 10-7mol/L组，E.OUA 10-6mol/L组，F.OUA 10-5mol/L组，G.OUA 10-4mol/L组。

图2各组大鼠心肌 HE 染色结果(×400)

2.5哇巴因对大鼠心肌组织中Na+-K+-ATP酶活性的影响与NC组相比，OUA 10-9mol/L和OUA10-8mol/L组的Na+-K+-ATP酶活性明显升高(P<0.05或P<0.01),OUA 10-7mol/L组心肌细胞膜内Na+-K+-ATP酶的活性无明显差异(P>0.05)，而OUA 10-6mol/L组、OUA 10-5mol/L组及OUA 10-4mol/L组的Na+-K+-ATP酶活性明显下降，差异具有统计学意义(F=154.71，P<0.01)。见图3。

*P<0.05，**P<0.01vs.NC group。

图3各组心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶活力比较

3讨论

哇巴因是强心苷类药物，作用于心肌细胞膜上的钠泵，导致细胞内Na+浓度升高，继而Na+-Ca2+交换增强，胞内Ca2+浓度增加，心肌收缩力增加[7]。哇巴因还常用来复制心律失常动物模型，传统认为其可能是通过抑制Na+-K+-ATP酶，使胞内的Na+和Ca2+浓度增加，引起心肌细胞钙超载，触发心肌电兴奋的后除极，从而诱发快速型心律失常[8]。龚冬梅等人亦发现给予5 μmol/L 哇巴因10 min后可明显缩短大鼠心室肌细胞动作电位时程，增加心肌细胞自律性，使除极和复极步调不能协调一致，易于产生异常冲动[9]。

我们的实验结果显示：较低浓度的OUA对离体心脏表现为强心作用，在OUA(10-9～10-7)mol/L组呈现出时间和浓度依赖性的强心作用，但Na+-K+-ATP酶的活力升高或没有影响，提示低浓度的OUA的强心作用可能不是通过抑制钠泵途径升高Ca2+浓度，使心肌收缩力增强，而可能是通过配体-受体信号转导通路实现的；Xie等[10-11]发现OUA可通过Na+-K+-ATP酶的信号转导通路调节基因转录和细胞生长，同时也使心肌细胞钙水平升高，进一步印证了我们的实验现象，与NC组相比，OUA(10-9～10-7)mol/L组均未诱发心律失常，心肌冠脉流出液中LDH活性与心肌形态学均无明显改变，这说明低浓度OUA除了增强离体心肌收缩力，还具有稳定心脏正常节律的作用；并且低浓度OUA与钠泵结合后能调节心肌细胞的分化、增殖，而不会诱导凋亡。亦有文献报道[12-13]OUA可抑制肿瘤细胞的增殖，有抗肿瘤的作用，但OUA低浓度范围内对正常细胞无毒副作用。Tian J等[14]人用低浓度哇巴因作用于猪肾近曲小管上皮细胞，发现OUA激活了猪肾近曲小管上皮细胞内的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路,从而促进猪肾上皮细胞的增殖。

当钠泵与哇巴因结合后，通过与周围膜蛋白相互作用引发一系列复杂的信号级联反应，其中包括Src(sarcoma gene)的活化、上皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)的激活、Ras与p42/44丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)的活化、阻滞细胞周期以及活化ERK1/2(extracellular regulated protein kinases)，导致细胞周期抑制因子p21Cip1表达升高和肿瘤抑制蛋白p53表达降低介导细胞凋亡[15-16]。本研究发现，OUA(10-6～10-4)mol/L组在最初给药时+dp/dtmax明显升高(灌流1 min以内)，短时间升高后继而出现一系列的毒害作用，收缩力下降，同时心律失常出现频率增加，心率下降，最终表现为心脏做功明显下降。同时灌流液中LDH的含量也明显增多，心肌形态学改变明显，心肌细胞间隙增宽，细胞水肿，碎裂等症状明显，并且呈现出浓度依赖性及时间依赖性，心肌中Na+-K+-ATP酶的活性明显下降,熊晨通过急性分离心室细胞发现，10-6mol/L的哇巴因可使心肌细胞出现不规则收缩，线粒体肿胀等毒害作用[17]。本实验结果表明，高浓度的哇巴因不仅能够抑制Na+-K+-ATP酶的活性，还能诱发心律失常，诱导心肌细胞的损伤、凋亡，从而对心脏呈现出剂量依赖性的抑制作用。

综合不同浓度哇巴因对离体心脏的作用，我们可以看出，哇巴因对心功能的影响是一个复杂的过程，涉及到钠泵的抑制与否，以及多条信号通路的激活，心律失常的发生等，关于具体通路与机制的研究有待于后续实验的进一步探讨。

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Dose-effect relationship of quabain on the cardiac function of isolated rat heart

WANGHaizhen，SHINa，WANGYaojun，WANGZhuqing,LIPanpan,JIANGYuxin,WANGJing,ZHOUPingping,WANGHaihua

Department of Physiology，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China

【Abstract】Objective：To observe the effect of different dosage of ouabain(OUA) on the isolated cardiac function in rats.Methods:Forty-two SD rats were randomized into 7 groups (n=6 for each)，namely：normal control group (NC group)，OUA 10-9mol/L group)，OUA 10-8mol/L group，OUA 10-7mol/L group，OUA 10-6mol/L group，OUA 10-5mol/L group and OUA 10-4mol/L group.Cardiac function index were evaluated by left ventricular systolic pressure (LVSP)，heart rate (HR)，the maximum upstroke velocity of intraventricular pressure (+dp/dtmax).The incidence of ventricular arrhythmias and arrhythmia score were determined.Coronary effluent was collected for estimating the activity of lactate dehydrogenase (LDH).The Na+-K+-ATPase content in myocardial tissues was determined，and myocardial injury was evaluated by H&E staining.Results:As compared with the NC group，The LVSP×HR and +dp/dtmaxon the OUA 10-9mol/L group had no significant difference (P>0.05 ) ,while the LVSP×HR and +dp/dtmaxwere increased on the OUA 10-8mol/L and 10-7mol/L groups (P<0.05 or P<0.01，respectively);The activity of Na+-K+-ATPase was significant higher in the OUA 10-9mol/L and 10-8mol/L groups(P<0.05 or P<0.01，respectively).OUA showed dose-dependent inhibition on cardiac function for each group rats with OUA concentration changing from 10-6mol/L to 10-4mol/L (P<0.01).The arrhythmia score was also enhanced significantly (P<0.01)，and the LDH level in coronary effluent was increased significantly.The activity of Na+-K+-ATPase of myocardial tissues showed a dose-dependent reduction (P<0.05 or P<0.01，respectively).Conclusion:Low concentration of OUA [(10-9～10-7mol/L)] can strengthen the cardiac function of the isolated heart，whereas excessive OUA[(10-6～10-4mol/L)] would inhibit the cardiac function in dose-dependent manner.

【Key words】ouabain;rats;isolated heart;dose-dependent

【文献标识码】【中图号】R 541.7A

作者简介：王海珍(1988-)，女，2013级硕士研究生，(电话)18375316283，(电子信箱)410960208@qq.com;

收稿日期：2015-09-04

基金项目：安徽省高校省级自然科学研究重点项目(KJ2013A251，KJ2016A729)；安徽省级大学生创新创业训练计划项目(AH201310368107)；皖南医学院大学生科研基金资助项目(WK2013S22)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201510368009)

文章编号：1002-0217(2016)02-0108-05

王海华，男，副教授，硕士生导师，(电子信箱)wanghaihua9972@sina.com，通讯作者.