毕赤酵母展示海藻糖合成酶及其性质研究

盛　敏，　谢　定*，　文　李，　焦　玲，　姜　博，　方　芳，　刘雄赳（.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南长沙404；.长沙帅牌油脂有限责任公司，湖南长沙40008）



毕赤酵母展示海藻糖合成酶及其性质研究

盛敏1，谢定*1，文李1，焦玲1，姜博1，方芳1，刘雄赳2
（1.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南长沙410114；2.长沙帅牌油脂有限责任公司，湖南长沙410008）

摘要：利用毕赤酵母表面展示天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）海藻糖合成酶（Trehalose synthesase，TS，EC 5.4.99.16）并研究其酶学性质。人工合成酵母内源壁蛋白（GPI-modified wall proteins，GCW14）与天蓝色链霉菌海藻糖合成酶组合DNA（GCW14-TS），将其亚克隆到pPIC9k载体后转化到GS115酵母菌中，成功构建了pPIC9k -GCW14-TS载体，并将TS展示在毕赤酵母GS115表面，然后对其酶学性质进行研究。发现其在30～45℃温度范围都能发挥作用，最适pH为8.5，K+、Mg2+等金属离子对其有促进作用且重复使用5次后仍然可以保持75%以上的酶活性。该基因工程菌具有海藻糖合成酶固定化酶性质，可用于将麦芽糖转化为海藻糖的产业化生产。

关键词：海藻糖合成酶；毕赤酵母；全细胞催化剂酶学性质

海藻糖（Trehalose）是两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷键相连而成的非还原性二糖，由于其具有对生物体优良的抗逆保护作用等优良性能而被誉为“生命之糖”和“二十一世纪的新型糖类”，在食品、保健、医疗等行业的应用越来越普遍，因而其大规模制造方法受到广泛关注[1]。在海藻糖酶法生产工艺中，利用海藻糖合成酶将麦芽糖转化成海藻糖的方法具有简单、快速、产业化生产成本低的特点[2]，因此，近些年越来越多的海藻糖合成酶基因被分离、提纯并在大肠杆菌中进行了表达[3-5]。但海藻糖合酶在大肠杆菌细胞内表达后需要破壁取酶，重组蛋白也易以包涵体的形式存在，因而存在酶量不够且难以重复利用等不足。近些年，酵母菌展示技术的应用研究越来越广。利用酵母菌展示酶作催化剂（也称全细胞催化剂whole cell catalyst）可以提高酶的产量，使用过程中无需分离纯化，且可重复利用，因而可以解决上述大肠杆菌细胞内表达该酶的不足。目前应用较多的为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与毕赤酵母（Pichaia pastoris），这两种表面展示系统是一种新型的真核表达系统，兼具原核生物易于培养繁殖快和真核生物蛋白翻译后的修饰功能两大系统的优点，可以高效表达外源蛋白而细胞内蛋白分泌极少，可以进行高密度发酵，可用于表达具有生物活性的外源蛋白[6-8]。相较于酿酒酵母，毕赤酵母表达外源蛋白糖基化程度较低，也具有乙醇氧化酶基因诱导型的强启动子。目前，已有毕赤酵母成功展示多种酶的报道，但尚未见毕赤酵母表面成功展示海藻糖合成酶的报道。本研究以毕赤酵母GS115作为细胞载体构建酵母表面展示系统展示海藻糖合成酶并初步研究了该全细胞催化剂的酶学性质。

1　材料和方法

1.1 GCW14-TS组合DNA

根据林影等[9]毕赤酵母内源壁蛋白（GPI-modified wall proteins，GCW14）序列以及韦宇拓等[10]的天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）海藻糖合成酶（Trehalose synthesase，TS，EC 5.4.99.16）序列，设计了酵母内源壁蛋白（GCW14）与天蓝色链霉菌海藻糖合成酶组合DNA（GCW14-TS）序列，GCW14-TS序列的5’端添加了Eco RI限制性内切酶位点，3’端添加了Not I位点。Eco RI-GCW14-TS-Not I由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pUC57载体的多克隆位点上，命名为pUC57-GCW14-TS。（6-360bp为GCW14，361-2058bp为TS）

GAATTC5’-6gcttactctaacgtaacttacacttacgagactac catcaccgatgttgtcaccgagctcaccacttactgcccagagccaaccacct tcgttcacaagaacaagaccatcactgtgaccgccccaaccactttgaccatc actgactgtccttgcaccatctccaagaccaccaagatcaccactgatgttcc accaaccacccactccaccccacacaccaccaccactcacgtgccatctac ctctaccccagctccaacccactctgtttctaccatctctcacggtggtgctgct aaggctggtgttgctggtttggccggtgttgctgctgccgctgcttacttcttg 360ATGATCGTCAACGAGCCCGTGCCGGACACCTT CGAGGACACCCCCGCCAAGGACCGGGACCCGGAC TGGTTCAAACGAGCCGTCTTCTACGAGGTCCTCGT CCGCTCCTTCCAGGACAGCAACGGCGACGGCATC GGTGATCTCAAGGGCCTGACCGCCAAGCTGGACT ACCTGCAATGGCTCGGCGTGGACTGCCTGTGGCT CCCGCCCTTCTTCAAGTCACCGCTGCGCGACGGCG GTTACGACGTCTCCGACTACACCGCCGTGCTGCCG GAGTTCGGCGACCTGGCCGACTTCGTGGAGTTCGT GGACGCGGCGCACCAGCGCGGCATGCGCGTGATC ATCGACTTCGTCATGAACCACACCAGCGACCAGC ACCCGTGGTTCCAGGAGTCCCGCAGGAACCCGGA CGGCCCCTACGGCGACTACTACGTCTGGGCCGAC GACGACAAGCAGTTCCAGGACGCGCGGATCATCT TCGTCGACACCGAGGCGTCCAACTGGACCTACGA CCCGGTGCGCAAGCAGTACTACTGGCACCGGTTC TTCTCCCACCAGCCGGACCTCAACTACGAGAACCC GGTCGTGCAGGAGGAGATGATCTCCGCGCTGAAG TTCTGGCTGGACCTGGGCATCGACGGGTTCCGGCT GGACGCGGTGCCGTACCTCTACCAGGAGGAGGGC ACCAACTGCGAGAACCTCCCGCGCACGCACGACT TCCTGAAGCGGGTGCGCAAGGAGATCGACGCGCA GTACCCGGACACGGTGGTGCTGGCCGAGGCCAAC CAGTGGCCGGAGGACGTGGTCGACTACTTCGGCG ACTACGCGGCGGGCGGCGACGAGTGCCACATGGC CTTCCACTTCCCCGTCATGCCCCGCATCTTCATGGC GGTCAGAAGGGAGTCCCGCTACCCGGTCTCCGAA ATCCTCGCCAAGACCCCGGCCATCCCGTCCGGCTG CCAGTGGGGCATCTTCCTGCGCAACCACGACGAG CTGACCCTGGAGATGGTCACCGACGAGGAACGCG ACTACATGTACGCGGAGTACGCCAAGGACCCGCGCATGCGCGCCAACATCGGCATCCGGCGCAGGCTC GCCCCGCTCCTCGACAACGACCGCAACCAGATCG AGCTGTTCACCGCCCTGCTGCTGTCCCTGCCCGGC TCGCCGATCCTCTACTACGGCGACGAGATCGGCAT GGGCGACAACATCTGGCTCGGCGACCGCGACGCC GTGCGCACCCCCATGCAGTGGACGCCCGACCGCA ACGCGGGCTTCTCGTCGTCCGACCCGGGCCGCCTG TTCCTGCCCACGATCATGGACCCGGTCCACGGTTA CCAGGTGACGAACGTCGAGGCGTCCATGGCCTCG CCCTCCTCCCTGCTGCACTGGACCCGGCGCATGAT CGAGATCCGCAAGCAGAACGTGGCCTTCGGCCTG GGCACCTACACCGAGCTGCCGTCGTCCAACCCTG CCGTCCTGGCCTTCCTGCGCGAACACGAGGACGA CCTGGTGCTGTGCGTCCACAACTTCTCCCGGTTCG CGCAGCCGACGGAGCTGGACCTCAGCGCCTTCGA CGGACGCCATCCGGTCGAGCTGTTCGGCGGGGTC CGCTTCCCGGCGGTCGGTGACCTGCCGTACCTGCT GACCCTGGGCGGTCACGGCTTCTACTGGTTCCGCC TGCGCAAGGACGCCGCC2058-3’GCGGCCGC（2066bp）

1.2主要仪器设备

琼脂糖凝胶电泳仪：DYCP-31DN型，北京天池仪诚生物科技有限公司产品；凝胶成像仪：DOC2000型，美国Bio-Red公司产品；恒温摇床：NS-2102C型，天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；紫外-可见分光光度计：UV2600型，上海舜宇恒平有限公司产品。

1.3其它材料和试剂

菌株和质粒：pPIC9K：购自美国Invitrogen公司；毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115宿主菌：购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；工具酶、试剂与试剂盒：限制性内切酶EcoR I、Not I、Mlu I、Sac I，T4 DNA连接酶，DNA Marker：购自大连宝生物科技有限公司（takara）；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒：购自德国Qiagen公司产品；PEG3350、LiCl：购于美国sigma公司；其他试剂为进口分装或国产分析纯。

1.4方法

1.4.1 pPIC9K-GCW14-TS载体的构建分别将pUC57-GCW14-TS和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切反应，37℃水浴4 h后用1.2 g/dL琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。采用凝胶回收试剂盒对目的基因片断GCW14-TS和pPIC9K载体片段进行回收。再用T4 DNA Ligase进行连接反应，22℃过夜连接，将其转化到DH5a感受态细胞中，并涂布在含有amp和kana抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养后挑取克隆进行摇菌培养，质粒抽提，并进行Eco RI和Not I双酶切反应，并用1.2 g/dL琼脂糖凝胶电泳鉴定。将阳性克隆命名为pPIC9KGCW14-TS。

1.4.2 pPIC9K-GCW14-TS转化到毕氏酵母GS115中按照如下步骤进行：煮沸1 mL鲑鱼精DNA 5 min，迅速冰浴后以制备单链担体DNA；将pPIC9KGCW14-TS用Sac I内切酶进行线性化处理；将感受态酵母菌GS115离心，用Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：PEG3350，240 mL；1 mol/L LiCl，36 mL；2 mg/mL单链Salmon sperm DNA，25 mL；0.1～0.2 mg/mL质粒DNA，50 mL；剧烈旋涡混匀至沉淀菌体完全分布均匀（约1 min）；30℃水浴孵育30 min；42℃水浴热休克20～25 min；6 000～8 000 r/min离心收集酵母菌体；重悬酵母于1 mL YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4 h后，取25～100 mL菌液铺YD选择性培养基平板，于30℃培养2～3 d鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30℃培养至转化子出现）。

1.4.3全细胞催化剂粗酶液的制备将毕赤酵母重组菌接种到YPD液体培养基中，30℃，180 r/min培养24 h进行活化。按体积分数1%的接种量转接至新鲜的BMGY培养基中，30℃，180 r/min培养4～5 d，每24 h添加甲醇进行诱导。收集发酵菌体，菌泥用pH 8.0缓冲液洗涤3次。经离心后得湿菌体，将离心后的湿菌体进行称重，并与本研究前期所采用的重组大肠杆菌同期培养后称重进行比较。取1 g湿菌体悬浮于5 mL Tris-Hcl缓冲液中，制得全细胞催化剂粗酶液。

1.4.4全细胞催化剂活力测定反应条件：将上述实验获得的粗酶液按体积比1∶1加入质量分数10%的麦芽糖溶液，在35℃、180 r/min反应20 h，沸水浴10 min灭酶。调节pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保温14 h，沸水浴10 min灭酶。测定酶活力。酶活力测定（3，5-二硝基水杨酸法，DNS法）[11]：葡萄糖标准曲线的绘制：分别取葡萄糖标准液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于15 mL刻度试管中，用蒸馏水补足至1 mL，准确加入DNS试剂2 mL，沸水煮沸2 min。冷却至室温后用水补足至15 mL，在540 nm波长下测定吸光度，并绘制标准曲线。样品液经过适当的稀释，取稀释后的样品液1.0 mL于15 mL刻度试管中，加入DNS试剂2.0 mL，沸水煮沸2 min，冷却至室温后用水补足到15 mL，在540 nm波长下测定吸光度。从葡萄糖标准曲线上查出稀释样品液中的葡萄糖质量浓度，再计算出原样品液的葡萄糖质量浓度。计算出酶活力。

酶活力定义：在上述条件下，每1 g湿菌体酶1 min催化转化麦芽糖产生1 μg海藻糖为1酶活力单位A（u）。

式中：Δx为葡萄糖差值微克数（空白-酶反应），μg；t为时间，min。

1.4.5全细胞催化剂的性质研究

1）发酵时间对全细胞催化剂的活性影响将种子液转移至BMGY培养基中培养后加甲醇诱导发酵，分别在12，24，36，48，60，72，84 h后取样，离心制得全细胞粗酶液，将粗酶液按体积比1∶1加入质量分数10%的麦芽糖溶液，在35℃、180 r/min反应14 h，沸水浴10 min灭酶。调节pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保温1 h，沸水浴10 min灭酶。测定酶活力。

2）温度对全细胞催化剂活性的影响将菌体重悬于pH8.0的Tris-Hcl缓冲液制得粗酶液，分别在30，35，40，45，50，55，60，65，70℃下保温30 min后，将粗酶液按体积比1∶1加入质量分数10%的麦芽糖溶液，在35℃、180 r/min反应14 h，沸水浴10 min灭酶。调节pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保温1 h，沸水浴10 min灭酶。测定酶活力。为测定其温度的稳定性，将全细胞催化剂粗酶液置于30，40，45，50℃的水浴锅中分别保温0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h后再按上述方法测定其酶活力。

3）pH值对全细胞催化剂活性的影响将菌体分别重悬于pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0的缓冲液后，30℃保温30 min。再以pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液洗涤并重悬菌体制得粗酶液将粗酶液按体积比1∶1加入质量分数10%的麦芽糖溶液，在上述反应确定的最适温度下180 r/min反应14 h，沸水浴10 min灭酶。调节pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保温1 h，沸水浴10 min灭酶。测定酶活力。为测定其pH值的稳定性，将全细胞催化剂重悬于pH为pH6 .0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0的缓冲液中，30℃保温24 h后，再以pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液洗涤并重悬菌体制得粗酶液，再按上述方法测定其酶活力。

4）金属离子对全细胞催化剂活性的影响用去离子水分别配置浓度为0.01 mol/L的Na+、K+、Mg2+、Zn3+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+等各种金属盐溶液，然后将这些金属盐溶液与同体积的酶反应体系在上述反应确定的最适温度下180 r/min反应14 h，沸水浴10 min灭酶。调节pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保温1 h，沸水浴10 min灭酶。测定酶活力。

5）全细胞催化剂固定化效果将使用过的全细胞催化剂用缓冲液洗涤3次后并重悬制得粗酶液，重复1.4.4的步骤测定全细胞催化剂的活力。

2　结果与分析

2.1 pPIC9K-GCW14-TS载体构建

分别将pUC57-GCW14-TS和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切反应，37℃水浴4 h之后用1.2 g/dL琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用胶回收试剂盒回收目的基因片断GCW14-TS和pPIC9K载体片段（图1）。之后用T4 DNA Ligase进行连接反应，22℃过夜连接，之后转化到DH5a感受态细胞中，涂布在含有amp和kana抗性的LB固体培养基上进行37℃过夜培养。挑取克隆进行摇菌，质粒抽提，并进行Eco RI和Not I双酶切反应，之后用1.2 g/dL琼脂糖凝胶电泳鉴定。将阳性克隆命名为pPIC9KGCW14-TS。

图1　琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis

Displaying of Trehalose Synthase Through Pichia pastoris and its Enzymatic Properties

SHENG Min1，XIE Ding*1，WEN Li1，JIAO Ling1，JIANG Bo1，FANG Fang1，LIU Xiongjiu2
（1. College of Chemical and Biology，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114，China；2. Changsha Handsome Brand Oil Limited Company，Changsha 410008，China）

Abstract：The study aimed to display trehalose synthase（TS.EC 5.4.99.16）on the surface of Pichiia pastoris and investigate its enzymatic properties. Synthesized gene from Streptomyces coelicolor trehalose synthase and yeast cell wall protein GCW14 was cloned to pPIC9k carrier and transformed into yeast GS115 and thus the pPIC9k-GCW14-TS carrier was constructed to display TS. Then the properties of the recombinant trehalose synthase were determined. Results showed that the recombinant trehalose synthase possessed the optimal temperature 30～45℃and pH 8.5，K+and Mg2+increased its enzymatic capacity and more than 75% of the activity was still remained after it was reused for 5 times. Therefore，this recombinant strain can be repeatedly use as a whole cell catalyst to convert maltose into trehalose.

Keywords：trehalose synthase，Pichaia pastoris，whole cell catalyst enzymatic properties

*通信作者：谢定（1962—），男，湖南耒阳人，工学博士，教授，硕士研究生导师，主要从事食品生物技术研究。E-mail：cslg5148495@126.com

基金项目：湖南省自然科学基金项目（2015JJ2010）；湖南省2011协同创新资助项目；长沙市重点科技项目（K1205230-11）。

收稿日期：2014-11-02

中图分类号：TS 261

文献标志码：A

文章编号：1673—1689（2016）01—0059—07