BAF/GM细胞株法在生长激素生物测定中的应用

罗燕飞，米热古丽·买买提，热衣兰木·包尔汉，李　静，史兆龙(新疆医科大学第一附属医院儿科，乌鲁木齐　830054)



BAF/GM细胞株法在生长激素生物测定中的应用

罗燕飞，米热古丽·买买提，热衣兰木·包尔汉，李静，史兆龙
(新疆医科大学第一附属医院儿科，乌鲁木齐830054)

摘要:目的探讨BAF/GM细胞株法测定正常儿童及特发性身材矮小患儿生长激素生物活性中的应用，为特发性身材矮小的病因学研究提供一定的实验依据。方法采用BAF/GM细胞株法建立体外生物测定系统，测定正常组儿童及特发性身材矮小患儿生长激素生物活性，同时采用免疫放射分析法测定其免疫活性。通过加入胰岛素、胰岛素样生长因子等评估该检测方法的稳定性，分析其对生长激素的阻断作用。结果(1)生长激素刺激BAF/GM细胞株的增殖呈剂量依赖性。(2)两组儿童血清生长激素生物活性和免疫活性比较差异均无统计学意义(P1=0．393，P2=0．54)。(3)游离胰岛素样生长因子在浓度＞30 ng/mL时刺激细胞增殖，且增殖呈剂量依赖性，其余生长因子对细胞增殖无影响。结论BAF-GM细胞株法测定生长激素生物活性具有较好的敏感性与特异性，是分析血清样本中生长激素的生物活性水平的一种切实可行方法。

关键词:生长激素;生物活性;BAF/GM细胞株;免疫活性;敏感

生长激素(growth hormone，GH)是由腺垂体分泌的一种蛋白激素，GH和由其介导的胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、胰岛素样生长因子结合蛋白等共同参与体内糖、脂肪、蛋白质等能量的代谢过程。生长激素的分泌异常与身材矮小密切相关［1］。目前被广泛使用于日常诊断和研究中的生长激素检测方法为放射免疫检测法［2－3］，其无法反映样本中的GH生物活性水平，而是从结构上反映与免疫原相关的化合物的结合免疫活性。近年来研究者们越来越意识到测定GH生物活性在某些内分泌疾病诊疗中的必要性。然而，只有少数研究报道使用生物活性的方法［4－5］。特发性身材矮小(idiopathic short stature，ISS)患儿生长激素免疫活性与正常儿童比较无明显差异，然而两者生物活性比较是否有差异尚待进一步探讨。因此，本研究拟寻找一种针对BAF-GM细胞株敏感的生物测定法，探讨正常儿童及ISS患儿血清生长激素生物活性与免疫活性的相关性，为临床生长激素生物活性的测定提供一种切实可行的方法。

1　对象与方法

1．1研究对象选择新疆医科大学第一附属医院2009年1月－2012年12月住院并确诊为特发性身材矮小患儿42例为试验组，男性20例，女性22例，平均年龄(5．18±0．14)岁。纳入标准:身高低于同龄、同性别和同地区正常健康儿童身高的2个标准差，出生体质量及生长激素测定均正常。排除标准:表型异常(如骨骼发育不良、先天性卵巢发育不良综合征等)、出生体质量及身长小于相应胎龄、生长激素缺乏、垂体功能减退等有明确病因的身材矮小者。选取同期新疆医科大学第一附属医院预防保健科体检的正常儿童52例为对照组，男性27例，女性25例，平均年龄(5．26±0．13)岁。两组患儿一般资料比较差异无统计学意义(P＞0．05)。所有样品采集均获得了患儿家属知情同意。

1．2材料与试剂标准人GH、人甲状腺刺激激素、人黄体生成素、人卵泡刺激素(阿斯生物制药公司，美国)，催乳素、成纤维细胞生长因子(ACRIS抗体有限责任公司，德国)，人表皮生长因子(Assay Designs，美国)，人类胰岛素样生长因子-1(IGF-1) (Stressgen，加拿大)，氢化可的松(天津药业)，诺和灵R(40IU)(诺和诺德，日本)，L-甲状腺素钠(Merck KGaA)，抗-GH抗体(Oy Medix Biochemica Ab公司，芬兰)，生长激素受体拮抗剂SOMAVERT(辉瑞制药，日本)，马血清(GIBCO)，培养基(Invitrogen)，微孔板(格雷纳生物-one CELLSTAR)。

1．3方法

1．3．1 BAF/GM细胞株(系)的建立在Ba/F3细胞中构建和转染人生长激素受体嵌合体的cDNA以及人血小板生成素受体的cDNA，使这些细胞对人生长激素有增殖敏感反应［2］，从而建立BAF/GM细胞株。

1．3．2生长激素生物活性的测定检测前16 h，先用培养液洗涤细胞，弃去上清后转移到含10%马血清的培养基中培养16 h，细胞离心弃去上清，重悬细胞，调整细胞浓度为3×105/mL，然后将每等份100 μL分别滴在96孔的微孔板中。将血清标本于56℃下灭活30 min，将10μL标准人GH或10μL血清标本滴加到盛有细胞悬液的96孔板中。在37℃、5%CO2培养箱内培养22 h。在培养结束时，用Cell Titer AQueous仪进行比色。每孔中加入22 μL反应液后，在相同条件下培养3 h。用THERMOmax分析仪确定细胞生物活性反应。在490 nm处和650 nm处测定光密度值，计算出待测样品的浓度。

1．3．3 BAF/GM细胞株特异性和稳定性将10μL催乳素、IGF-1、诺和灵R、氢化可的松、黄体生成素、卵泡刺激素、促甲状腺激素、L-甲状腺素钠、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子加入至每一孔，进一步检测评估BAF/GM细胞株特异性和稳定性。

1．3．4生长激素免疫活性的测定采用放射免疫分析法(IRMA)测定血清人生长激素的免疫反应活性。

1．3．5生长激素激发试验采用左旋多巴联合可乐宁行生长激素激发试验后再次采血，按照上述方法检测ISS患儿血清的GH生物及免疫活性。

1．4统计学处理用SPSS17．0软件进行统计学分析，两组GH生物活性及免疫活性采用t检验。采用Mann-Whintney U检验比较两组B/I比值，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2　结果

2．1生长激素活性测定结果试验组血清样GH的生物活性和免疫活性分别为(1．12±0．38)、(1．04± 0．37)(ng/mL)，对照组分别为(2．12±0．66)、(2．03± 0．74)(ng/mL)，生物活性与免疫活性比较差异均无统计学意义(P1=0．393，P2=0．54)(图1)。

2．2 hGH及IGF-1刺激BAF/GM细胞生长对比

BAF/GM细胞株(系)在生长激素生物检测中的特异性GH刺激BAF/GM细胞株的增殖呈剂量依赖性，在＜0．020 ng/mL人GH标准液和人血清中均呈现其敏感性，刺激细胞生长。在人血清稀释范围0．69%～11%的最终浓度液中刺激细胞生长。除了游离IGF-1，其余生长因子均不影响细胞生长增殖。游离IGF-1＞30 ng/mL时刺激细胞增殖，且增殖呈剂量依赖性，随着IGF-1浓度的增高，细胞增殖速度逐步增快(图2)。

图1　生长激素活性测定结果

图2　hGH及IGF-1刺激BAF/GM细胞生长对比

2．3生长激素激发试验结果GH激发试验中，生物活性和免疫活性的基值分别为(1．12±0．38)、(1．04±0．37)ng/mL(P=0．393);峰值分别为(9．18 ±2．18)、(8．86±2．3)ng/mL(P=0．532)。GH激发试验前、后生长激素生物与免疫活性比较差异无统计学意义(P＞0．05)。

3　讨论

随着GH测定在临床实践中的应用和与生长激素相关疾病的诊断标准的不断发展，临床实验室必须要应对不断增加的生长激素测定的需求。目前常见的生长激素检测是基于各种免疫学检测方法［2－3］。虽然这些免疫检测方法被广泛使用在日常临床诊断和研究中，但其主要缺陷为其可能无法反映样本中的激素生物活性水平。尽管之前研究的检测方法对人GH(浓度＜0．02 ng/mL)非常敏感，但其需使用抗催乳素抗体来消除催乳素的干扰，当其被应用到血清时，其灵敏度极限约为2ng/mL［6］。近年来的有关研究显示使用Ba/F3细胞增殖生物测定法，人GH在1 ng/mL中会出现2倍以上的灵敏度，但是在＜1 ng/mL的检测极限下，敏感性较低，并且留有不能量化人血清样本中实际体细胞生长活动的问题［7－8］。因此探讨新的检测方法势在必行。本研究结果显示BAF-GM细胞株检测法具有最低检测极限，即＜0．02 ng/mL的检测灵敏度。当应用于人血清样本时，此法与近期改进后的细胞增殖生物检测法相比，具有50～100倍的灵敏度。

本研究结果检测方法只需耗费22 h的细胞培养时间即能测量到结果，与Ba/F3法所需要的48 h的细胞培养时间相比，耗费时间较少。

本研究显示:当加入人抗-GH抗体时，BAF/GM细胞株的增殖呈现剂量依赖性，并且抗-GH抗体阻止细胞增殖，生长激素受体拮抗剂阻止所有生长激素激活的受体的生物活性，表明该测定方法依赖于生长激素-生长激素受体的信号转导。另外，本研究还显示除了游离IGF-1，其他激素和生长因子的生物活性几乎无效。这一结果支持了细胞株的特异性［8］。游离IGF-1只有在其浓度＞30 ng/mL时才可诱导生长激素的生物活性，然而该浓度超出了人体正常生理条件，因为大多数循环中的IGF-1(97%～99%)以IGF-结合蛋白(IGFBPs)的形式存在，只有2%～3%的IGF-1在人体内呈游离状态。游离IGF-1在体内含量最高时也＜25．28 ng/mL［9－10］。因此，血清标本中的IGF-1不会影响细胞增殖，不会影响GH生物活性的检测。

本研究结果显示:血清中人GH的生物活性和免疫反应活性有很好的相关性，GH激发试验中两者亦无明显差异。这与Ishikawa等［10］的检测结果一致。但本研究与Jennifer等［11］的生物检测结果相反。GH的生物活性在生长激素激发试验中的峰值趋向于超过免疫活性峰值［12－13］。上述差异可能是由于在循环中存在不同生长激素亚型分布的瞬态变化，也可能是血清中其他生长刺激因素引起的这一现象，如白细胞介素、集落刺激因子、IGF-1等。本研究结果排除了上述因素的影响，表面BAF/GM细胞株检测法具有一定的稳定性和可靠性。

综上所述，BAF/GM细胞株检测法是一种敏感、特异、稳定的生物检测系统，为检测血清样本中的GH生物活性水平提供了一种切实可行的方法。虽然该检测方法应用于临床仍需一定的时间与努力，但其为测定不同的与GH有关的疾病发展过程中GH生物活性水平的变化开启了一条新型的检测途径，从而为临床疾病的诊断与治疗提供一定的实验依据。

参考文献:

［1］Kristrom B，Dahlgren J，Niklasson A，et al．The first-year growth Response to growth hormone treatment predicts the long-term prepubertal growth response in children［J］．BMC Med Inform Decis Mak，2009，9(3):1-10．

［2］Takahashi Y，Shirono H，Arisaka O，et al．Biologically inactive growth hormone caused by an amino acid substitution［J］．JClin Invest，1997，100(4):1159-1165．

［3］Birzniece V，Nelson AE，Ho KKY．Growth hormone and physical performance［J］．Trends Endocrinol Metab，2011，22(5): 171-178．

［4］Bozzola M，Radetti G，Buzi F，et al．Growth hormone bioactivity and immunoactivity in tall children［J］．JEndocrinol Invest，1999，22 (7):541-546．

［5］Hanglian Lan，Zuoming Nie，Yue Liu，etal．In Vivo Bioassay of Recombinant Human Growth Hormone Synthesized in B．mori Pupae ［J］．JBiomed Biotechnol，2010，20(10):306-462．

［6］Dattani M，Hindmarsh P，Pringle，P，et al．The measurement of growth hormone bioactivity in patient serum using an eluted stain assay［J］，JClin Endocrinol Metab，1995，80(9):2675-83．

［7］Wada M，Ikeda M，Takahashi M，et al．The full agonistic effect of recombinant 20 kDa human growth hormone on CHO cells stably transfected with hGH receptor cDNA［J］．Mol Cell Endocrinol，1997，133(7):99-107．

［8］Ishikaw M，Nimura A，Horikawa R，et al．A novel-specific bioassay for serum hGH［J］．J Clin Endocr?Metab，2000，85(5): 4274-4279．

［9］Holt R，Erotokritou M，McHugh C，et al．The GH-2004 Project:the Response of IGF1 and TypeⅢPro-Collagen to the Administration of Exogenous GH in Non-Caucasian Amateur Athletes［J］．Eur J Endocrinol，2010，163(1):45-54．

［10］Obara M，Kedzia A，Koman E，et al．Usefulness of growth homone(GH)stimulation tests and IGF-Iconcertration measurement in GH deficiency diagnosis［J］．J Pediatr Endocrinol Metab，2008，21(6):569-579．

［11］Jennifer E，Nicholas J，Kinchuen L，et al．A novel bioassay for human somatogenic activity in samples supports the clinical reliability of immunoassays［J］．Clin Endocrinol，2002，56(3): 475-485．

［12］Baumann G，Stolar M．Molecular formsof human growth hormone secreted in vivo:non-specificity of secretory stimuli［J］．J Clin Endocrinol Metab，1986，62(4):789-790．

［13］Bang P，Bjerknes R，Dahlgren J，etal．A comparison of different definitions ofgrowth response in shortprepubertal children treated with growth hormone［J］．Horm Res Paediatr．2011，75(5): 335-345．

(本文编辑周芳)

Application of the BAF/GM cell lines in grow th hormone bioactivity measurement

LUO Yanfei，M ireguliM aimaiti，Reyilanmu Baoerhan，LI Jing，SHIZhaolong
(Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi830054，China)

Abstract:Objiective To establish a new bioassaymethod for GH bioactivity．By using thismethodology，to evaluate the availability of themethod through an intensive GH bioactivity assay of samples in idiopathic short stature (ISS)．M ethods Establish BaF/GM cell line，then evaluate the availability of the method through an intensive GH bioactivity assay on ISSand control，aswell asmeasure its immuno-activity by radiometric assay(IRMA)．And evaluate the stability of the testingmethod by test insulin and insulin-like growth factor 1(IGF-1)to observe its inhibition on growth hormone．Results(1)The hGH stimulated BaF/GM cell proliferation in a dose-dependent manner and this bioassay was sensitive even at－0．020 ng/mL．(2)There were no statistically significant differences between the two groups in bioactivity and immunoactivity(P1=0．393，P2=0．54)．(3)IGF-1 increased cell proliferation at a concentration ofmore than 30 ng/mL and stimulated the cell proliferation in a dose-dependentmanner．Conclusion Thus the newly developed system is a specific，sensitive，easy and fastbioassay system for GH determination and it is useful for evaluation of GH bioactivity in the variety of endocrine states．

Keywords:growth hormone;bioactivity;BaF/GM cell line;sensitive;immuno-activity

［收稿日期:2015-11-04］

通信作者:米热古丽·买买提，女(维吾尔族)，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向:小儿内分泌及遗传代谢病，E-mail:milikita17@aliyun．com。

作者简介:罗燕飞(1984－)，女，硕士，住院医师，研究方向:小儿内分泌及遗传代谢病。

基金项目:国家自然科学基金(81360139)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．009

中图分类号:R72;R446

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0298-04