粗榧种子休眠原因及其解除方法研究

司倩倩 臧德奎 傅剑波 刘济祥

摘 要：通过测定种子活力、种皮透水性、不同部位浸提液的生物活性，研究了粗榧种子休眠原因，并采用低温层积打破休眠。结果表明：粗榧种子生活力为90%，具备较大的发芽潜力；粗榧种皮及胚乳（含胚）中均含有萌发抑制物质，且胚乳（含胚）抑制强度大于种皮；机械束缚和萌发抑制物的存在是造成种子休眠的原因，采用低温层积处理可以打破种子休眠。

关键词：粗榧； 休眠原因； 机械束缚； 萌发抑制物； 低温层积

中图分类号：S664.5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）05-0042-04

Abstract The causes of seed dormancy of Cephalotaxus sinensis （Rehd. & Wils.） Li were investigated through detecting seed viability， water permeability of seed coat and bioactivity of extracts from different parts of seeds. And the cold stratification was used to break dormancy. The results showed that the seed viability was 90% with greater germination potential. There were germination inhibitors in seed coat and endosperm （including embryo）， and the inhibiton of endosperm （including embryo） was stronger than that of seed coat. The mechanical restraint and the existence of germination inhibitors were the causes for seed dormancy. Cold stratification was an effective way to break seed dormancy of Cephalotaxus sinensis.

Key words Cephalotaxus sinensis （Rehd. & Wils.） Li； Dormant cause； Mechanical restraint； Germination inhibitor； Cold stratification

粗榧[Cephalotaxus sinensis （Rehd. & Wils.） Li]又名中国粗榧、粗榧杉，为三尖杉科三尖杉属植物。粗榧属于第三纪孑遗植物，是我国特产树种[1]，自然分布于长江流域及以南地区[2]，但具有较强的耐寒性，在北京可以露地越冬。粗榧用途广泛，可在园林中作观赏植物栽培，经修剪造型可制作盆景。此外，粗榧中含有多种生物活性物质，在医学[3，4]、毒理学[5，6]、植物化学[7]等领域具有广阔的应用前景。生产上一般采用播种繁殖，但成熟种子有休眠特性[8]，落地后翌年或第三年才能发芽[9]，给林业生产带来诸多不便。本研究对粗榧生活力、种皮透水性、不同部位浸提液生物活性进行测定，以期掌握其种子休眠原因并探索打破休眠的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用粗榧种子采自河南伏牛山成年树上。在水中浸泡3～5 d，每天换水，反复搓洗以去掉假种皮，并用清水淘洗，得到纯净种子，阴干，放在低温干燥处保存。

种子浸提液生物测定所用白菜种子为北京益丰惠农农业科技研究所的“四季小白菜”，纯度95.0%，净度98.0%，发芽率>85%，含水量约为8.0%。

1.2 方法

1.2.1 生活力测定 采用TTC染色法快速测定种子生活力[10]。

1.2.2 无菌条件下种子萌发试验 先将浸泡48 h的种子用1‰升汞消毒4 min，75%医用酒精消毒7 min，将种子分为两组，其中一组去掉外种皮，在无菌条件下将种子接种在MS培养基上，然后放在恒温培养箱中25℃培养，光照时间为12 h·d^-1，每组接种100粒种子，定期观察发芽和生长情况，30 d统计发芽率。

1.2.3 种皮透水性测定 采用称重法：分别随机抽取完整种子、破皮种子（将种皮敲出一条裂缝）各50粒，称重后放在 25℃恒温培养箱中，用去离子水浸泡。每隔2 h取出种子（12 h后，每12 h取一次），用吸水纸吸干表面水分，在 1/1 000 电子天平上称重，直至种子重量不再变化为止。每处理设置 3 次重复，计算其吸水率。

吸水率（%）=（吸水后质量-吸水前质量）/吸水前质量×100

1.2.4 种子浸提液生物测定 参考王小平等[11]的提取方法。准确称取粗榧种皮、胚乳（胚）各2.0 g，用80%甲醇研磨，定容至50 mL，于4℃培养箱中振荡提取48 h，过滤，重复1次。35℃减压浓缩后用去离子水定容至20 mL，分别稀释成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·mL^-1的溶液，在培养皿中加入各浓度提取液5 mL，各放50粒提前浸泡2 h的白菜种子，在光照培养箱中进行发芽试验，以同体积蒸馏水为对照，设置3次重复，48 h后记录白菜种子的发芽率（以胚根露出3 mm为发芽标准）。

1.2.5 层积催芽 采用低温层积方法：种子经0.3%高锰酸钾消毒30 min后，用30～40℃温水浸泡48 h，然后将沙子与种子以3∶1的比例混匀（层积所用沙含水量保持在 60%左右），埋藏在背风向阳处，埋藏深度为50 cm。定期测定发芽率。

2 结果与分析

2.1 种子形态特征与休眠的关系

粗榧种子椭圆形，外种皮褐色，具有极浅的雕刻状花纹，骨质，硬度较大，对种子萌发产生机械束缚。由种子发芽试验可知，在25℃光照恒温培养箱中培养30 d后，完整种子和去壳种子均未发芽，继续培养30 d，种子出现发霉现象，但均未有萌发迹象。TTC法测定种子生活力结果表明，经TTC染色后，大部分胚和胚乳被染色，染色率达到90%以上，即种子生活力达到90%以上。但发芽试验中，种子均不能萌发，说明种子存在深度休眠现象。

2.2 种皮透水性测定

由图1可知，完整种子和破壳种子的含水量变化趋势大致相同，在处理前期，含水量均有不同程度增加。破壳种子36 h内为快速吸水期，含水量达到37.62%，约占总吸水量的86.68%，36～96 h吸水速度减慢，占总吸水量的12.97%，96 h以后逐渐趋于饱和；完整种子60 h内吸水相对较快，含水量达到36.27%，占总吸水量的83.86%，60～96 h吸水速度减慢，96 h之后逐渐达到饱和状态。吸水饱和之前，破壳种子的吸水速度明显高于完整种子，达到饱和状态时，两种处理的种子含水量基本一致，这表明粗榧骨质种皮对吸水透性有一定的阻碍作用，但不是休眠的主要原因。

2.3 种子浸提液生物测定

由表1可知，各浓度浸提液处理的白菜种子发芽率与对照的差异均达到了极显著水平（P<0.01），表明粗榧种皮、胚乳（胚）均对白菜种子萌发有抑制作用，且抑制强度与浸提液浓度呈正相关。种皮与胚乳（胚）对白菜种子发芽率的抑制程度差异显著。浸提液浓度为0.02 g·mL^-1时，种皮浸提液处理的白菜发芽率为45.33%，比对照减少52.45%，胚乳（胚）发芽率为26.67%，比对照减少72.02%，发芽率仅比浓度为0.06 g·mL^-1的种皮浸提液处理的种子高不到2%；当浸提液浓度为0.10 g·mL^-1时，提取液对白菜种子的抑制作用最强，种皮提取液处理的白菜种子发芽率为8.00%，比浓度为0.06 g·mL^-1时胚乳（胚）提取液处理的种子低14.26%，此浓度时，胚乳（胚）提取液处理的白菜种子发芽率为3.33%，比对照减少96.51%。这表明胚乳（胚）中的抑制物抑制强度大于种皮。

2.4 层积对种子发芽率的影响

如表2所示，层积30、60 d时，种子没有萌动迹象；随层积时间的延长，发芽率从层积90 d的6.78%上升到150 d时的41.55%。层积过程中，种子含水量随层积时间延长而不断增加，层积150 d时，含水量由层积30天的34.20%增加到40.48%。表明种子发芽不仅与层积时间密切相关，还与含水量有一定联系，种子只有达到或接近水饱和状态时才开始萌发。层积过程中，随着时间延长，种子腐烂数量不断增加，层积150 d时烂种率高达17.78%。

3 结论与讨论

有些种子的种皮由于坚硬、结构致密或具有很厚的蜡质层，导致种皮透气、透水性差，甚至产生束缚作用，若胚不能产生足够的推力突破这些组织，种子便不会萌发。野茉莉坚硬厚实的种皮是影响其萌发的机械障碍[12]；抑制物质普遍存在于休眠的种子中，抑制物质的存在是导致种子休眠的一个重要因素。自然界中很多植物如滇重楼[13]、藏茴香[14]、血皮槭[15]等种子均含有萌发抑制物质。

本研究中，粗榧种子种皮骨质，坚硬致密，对种子产生机械阻力，导致种子不易萌发；经破壳处理后，吸水率大于完整种子，但两者饱和含水量无显著差异，且两者达到饱和含水量所需时间较短（120 h），与粗榧长达2～3年的休眠期相比可以忽略不计，说明粗榧种子虽然具有一定透性障碍，但不是种子休眠的主要原因。这与刘成功等[16]的研究结果相一致。种子提取液处理的白菜种子发芽率均小于对照，且胚乳（胚）提取液处理的白菜种子发芽率低于种皮，表明粗榧种皮和胚乳（胚）中均含有抑制物质，且胚乳（胚）含量大于种皮，种子中含有内源抑制物是造成种子休眠的主要原因。

层积是一种常用的打破休眠的有效方法，尤其对因含萌发抑制物质而休眠的种子效果显著[17]。本研究中，低温层积处理能显著影响粗榧种子发芽率，在一定低温条件下，适当延长处理时间，能有效提高粗榧种子发芽率。在层积过程中，随着时间延长，烂种率也不断提高，因此应将其他打破种子休眠的方法如酸蚀、外源激素处理等同低温层积结合使用，以缩短层积时间，减少烂种率。但哪种处理组合最适合粗榧种子，还需要进一步验证。

参 考 文 献：

[1] 刘晓菊，王冬，于德林，等. 粗榧在熊岳地区的引种表现及繁育技术[J]. 北方园艺，2013（8）：85-87.

[2] 周秀佳，胡之璧，黄炼栋，等. 中国三尖杉属植物资源研究[J]. 湖北农学院学报，1997，17（2）：22-25.

[3] 钟三保，刘维勤，李仁利，等. 三尖杉酯类生物碱的半合成及结构与抗肿瘤活性的关系[J]. 药学学报，1994，29（1）：33-38.

[4] 李晓，卢家祥. 抗白血病药物——三尖杉酯碱类生物碱研究进展[J]. 新药与临床，1989，8（6）：350-353.

[5] 李雪娇.203种植物杀虫活性筛选及中国粗榧杀虫作用初步研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.

[6] 文艳华，冯志新，徐汉虹，等. 植物抽提物对几种植物病原线虫的杀线活性筛选[J]. 华中农业大学学报，2001，20（3）：235-238.

[7] 魏艳，郝双红，张兴. 中国粗榧提取物除草选择作用初探[J]. 农药，2009，48（7）：532-534.

[8] 中国科学院华南植物研究所.海南植物志[M].第1卷.北京：科学出版社，1994：219.

[9] 庞晓慧，宋经元.海南粗榧的资源学研究进展[J]. 陕西农业科学，2010（1）：119-121.

[10]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000：207-208.

[11]王小平，王九龄.白皮松种子内含物的提取、分离及生物测定[J].种子，1998，17（5）：19-22.

[12]王丽，王奎玲，刘庆超，等. 赤霉素处理及层积处理对野茉莉种子萌发的影响[J]. 江西农业学报，2010，22（3）：77-79.

[13] 陈伟，杨奕，马绍宾，等.滇重楼种子休眠类型的研究[J].西南农业学报，2015，28（2）：783-786.

[14]沈宁东，韦梅琴，李军乔. 藏茴香种子休眠机理的初步研究[J]. 中国种业，2010（8）：55-57.

[15]张川红，郑勇奇，吴见，等. 血皮槭种子休眠机制研究[J]. 植物研究，2012，32（5）：573-577.

[16]刘成功，陈黎，李燕，等.南方红豆杉种子休眠特性及催芽技术研究[J].西南林业大学学报，2015，35（3）：25-29.

[17]尹黎燕，王彩云，叶要妹，等. 观赏树木种子休眠研究方法综述[J]. 种子，2002（1）：45-47.