害螨胁迫对富士苹果叶片细胞超微结构及游离脯氨酸含量的影响

张坤鹏 孙瑞红 杨洪强

摘要：为明确山楂叶螨、二斑叶螨和苹果全爪螨胁迫对富士苹果叶片细胞超微结构及山楂叶螨胁迫对叶片游离脯氨酸含量的影响，利用透射电镜观察了上述3种害螨取食6 d 时叶片细胞超微结构的变化，并采用酸性茚三酮法测定了游离脯氨酸含量。结果显示，正常苹果叶片细胞呈长方形，大小相近，细胞排列整齐，细胞质中细胞器分布有序，细胞界限清晰；细胞内叶绿体数量较多，呈船形，紧贴细胞壁分布；细胞核呈长椭圆形，核仁和核膜清晰可见；细胞膜和细胞壁完整，相邻细胞壁界限明显。叶片被害螨刺吸为害后，叶肉细胞内部结构严重受损，细胞间隙增大，叶绿体和细胞核变形，叶绿体内有淀粉粒出现，严重影响细胞功能。山楂叶螨为害后的细胞壁上出现针状结晶沉淀物。山楂叶螨刺吸取食过程中，苹果叶片内游离脯氨酸含量随受害时间延长和螨口密度提高总体呈先升后降的趋势。害螨为害可破坏苹果叶片细胞超微结构，导致细胞功能丧失，抗逆性物质游离脯氨酸含量的升高表明苹果叶片对山楂叶螨取食的对抗。

关键词：富士苹果；山楂叶螨；二斑叶螨；苹果全爪螨；细胞超微结构；游离脯氨酸

中图分类号：S661.103.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0036-06

山楂叶螨Tetranychus viennensis、二斑叶螨T. urticae和苹果全爪螨Panonychus ulmi是为害苹果叶片的3种重要害螨[1]，广泛分布于我国各苹果产区，造成叶片光合作用下降甚至提前落叶，抑制树体生长和花芽形成，给苹果生产造成严重损失。

植物生长发育过程中常会遭遇不同逆境胁迫，逆境胁迫可分为生物、化学胁迫和物理胁迫3类，虫害胁迫属于典型的生物胁迫[2]。植物被刺吸性害虫取食后，叶肉细胞会产生生理、生化及形态结构等一系列生物学变化。研究表明，褐飞虱Laodelphax striatellus为害水稻稻叶后，会引起叶片细胞质壁分离、叶绿体异常发育、结构松散，膜结构最终溶解或断裂[3，4]。梨网蝽Stephanitis nashi为害梨叶后，叶肉细胞中叶绿体膜被破坏，片层结构排列松散，最终瓦解，个别细胞线粒体内部嵴数目减少，基质变稀薄，有些细胞叶绿体内出现淀粉粒，严重时细胞凋亡，只剩残片[5]。桔始叶螨Eotetranychus kankitus为害柑桔叶片后，导致叶片叶绿体膜缺损，淀粉粒异常膨大，基粒片层排列不规则，甚至消失，嗜锇颗粒数目明显增多[6]。朱砂叶螨T. cinnabarinus为害棉叶后，叶绿体膜逐渐溶解，基粒片层排列混乱，片层结构消失，淀粉粒增多，有些细胞被完全破坏[7]。桑始叶螨Eotetranychus suginamensis为害桑叶后，叶绿体外被膜出现多处断裂，基粒片层和基质片层排列杂乱并产生较大空洞，细胞质中出现致密颗粒和膜状物[8]。

植物体内游离脯氨酸含量常作为评价植物抗逆性高低的一项生理指标。菜豆叶片游离脯氨酸含量随二斑叶螨为害时间延长明显增加[9]。番茄刺皮瘿螨Aculops lycopersici为害后，番茄叶片游离脯氨酸含量急剧升高，并且随为害时间延长和接螨量增加而持续上升[10]。梨瘿螨Eriophyes pyri和梨叶锈瘿螨Epitrimerus pyri为害后，梨树叶片游离脯氨酸含量明显上升，并随受害程度逐渐加重。游离脯氨酸含量升高主要集中在为害部位，同时也会引起受害部位周围组织游离脯氨酸含量上升[11]。梨叶锈瘿螨取食苹果梨叶片引起的游离脯氨酸含量的变化与窦彩虹的研究结果相似[12]。臭椿被太行瘿螨Aculops taihangensis为害后，叶片内游离脯氨酸含量增加，反映出臭椿对太行瘿螨的抵抗，但螨口数量的增长会终止游离脯氨酸含量上升[13]。梅下毛瘿螨Acalitus phloeocoptes为害杏树嫩芽后，受害芽的游离脯氨酸含量最高上升69.44%[14]。

目前，关于苹果叶片受到害螨为害后细胞超微结构及游离脯氨酸含量变化的研究尚未见报道。为此，本研究进行了这方面的试验，旨在为研究富士苹果对害螨为害的响应机制奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试树网室内的盆栽苹果树，品种为短枝富士，树龄3年。

1.1.2供试螨山楂叶螨、二斑叶螨和苹果全爪螨均采自山东省泰安市郊区苹果园。然后连续饲养于室内盆栽海棠苗上，养虫室条件为温度（26±1）℃，相对湿度（60±10）%，光周期12 L∶12 D。

1.2试验方法

1.2.1细胞超微结构观察选择健康盆栽苹果苗，按10头/叶的螨口密度分别将上述3种害螨的雌成螨接到不同植株的成熟叶片上，在叶柄处涂抹凡士林防止螨逃逸，每种害螨接2株树，重复3次，空白对照不接螨。

接螨6 d时，分别剪取处理叶片及对照叶片。在叶片叶螨刺吸点处切取0.5 mm2小块，迅速置于4%戊二醛溶液中进行固定。用注射器抽气3次，固定后用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液漂洗，然后用1%锇酸固定，再用乙醇-丙醇梯度脱水。之后用Epon 812环氧树脂渗透包埋，使用LKB-5型超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，置于JEM-1200EX型透射电镜下观察细胞超微结构并拍照。

1.2.2游离脯氨酸含量测定分别将山楂叶螨雌成螨按10、20、30 头/叶3个螨口密度接到不同植株的成熟叶片上，每处理4株，重复3次，叶柄处涂抹凡士林防止螨逃逸。以不接螨处理做空白对照。分别在为害6、8、10 d时摘取各处理叶片，于-24℃低温保存。

酸性茚三酮试剂：称取茚三酮2.5 g，加入冰乙酸60 mL和6 mol/L磷酸40 mL，于70℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，冰箱内4℃保存。

称取10 mg脯氨酸溶于少量80%乙醇溶液内，蒸馏水定容至100 mL，浓度为100 μg/mL。分别吸取0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 mL放入50 mL容量瓶内，蒸馏水定容，配成0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg/mL标准液。分别吸取各标准液2 mL、冰乙酸2 mL、茚三酮试剂2 mL放入10 mL带塞刻度试管内，在沸水中放置15 min，取出后于520 nm光波处测定吸光值。以脯氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

称取苹果叶片0.3 g，剪碎，加入适量80%乙醇液和少量石英砂研磨成浆，转移至10 mL带塞刻度试管内，用80%乙醇液洗涤残渣，定容至10 mL，80℃水浴提取20 min。提取液中加入1勺人造沸石和适量活性炭，强烈振荡5 min以去除干扰的氨基酸，过滤。

按照标准曲线测定方法对试样进行测定，每处理重复测定3次，利用标准曲线和游离脯氨酸含量计算公式计算游离脯氨酸含量，用Duncans新复极差检验法进行差异显著性分析。

脯氨酸含量（μg/gFW）=X×VFW

式中，X为根据标准线算得的样品浓度值（μg/mL），V为样品液总体积（mL），FW为样品鲜重（g）。

2结果与分析

2.1苹果叶片细胞超微结构变化

2.1.1正常叶片的细胞学特征正常苹果叶片表皮和叶肉细胞呈长方形，大小相近，细胞排列整齐，细胞质中细胞器分布有序，细胞间隙明显。细胞内叶绿体数量较多，呈船形，紧贴细胞壁分布。细胞核呈长椭圆形，核仁和核膜清晰可见。细胞膜和细胞壁完整，相邻细胞壁界限明显（图1）。

2.1.2山楂叶螨为害叶片的细胞学特征山楂叶螨刺吸为害苹果叶片6 d，叶肉细胞严重变形，细胞间隙变大，细胞器散乱于细胞质内，细胞内容物溢出，有些细胞仅在细胞壁周围残存一些碎屑，几乎成为空胞（图2A、E）。叶绿体内出现淀粉粒，肿胀趋于圆球状，甚至叶绿体膜消失，叶绿体溶解散乱在细胞质中（图2A、B）。细胞核被其他细胞器挤压变形，细胞膜逐渐消失，细胞核解体（图2C）。细胞壁分解断裂，相邻细胞壁界限逐渐模糊，最终消失形成空胞（图2B、C、D、E），甚至紧邻栅栏组织的上表皮细胞壁也分解断裂（图2D），有些细胞壁上附着针状结晶沉淀物（图2F）。

2.1.3二斑叶螨为害叶片的细胞学特征二斑叶螨为害6 d，苹果叶片细胞受到不同程度破坏，细胞质减少，细胞间隙增大，叶绿体缩短膨胀变形，叶绿体中可见大量淀粉粒存在，细胞核核膜界限不清（图3A），受害严重的细胞几乎完全被破坏，细胞器降解甚至消失，细胞壁溶解断裂，弯曲变形，细胞器残渣外溢到细胞间隙内（图3A、B、C）。

2.1.4苹果全爪螨为害叶片的细胞学特征苹果全爪螨为害6 d，苹果叶肉细胞内部结构发生巨大变化，叶绿体由长椭圆形变为近圆形，其内有淀粉粒沉积，受害严重的细胞结构几乎完全被破坏，细胞器只剩残渣或消失，只剩细胞壁残余框架（图4A）。细胞壁界限趋于模糊，细胞器残余物从细胞壁缺口处溢出细胞（图4B、C）。

2.2叶片内游离脯氨酸含量变化

2.2.1游离脯氨酸标准曲线经过Microsoft Excel分析确定，脯氨酸标准回归方程为Y=0.0365X-0.0237，R2=0.9964。其中Y为520 nm的吸光值，X为脯氨酸浓度（μg/mL）。

2.2.2山楂叶螨为害对苹果叶片游离脯氨酸含量的影响从表1可知，与对照叶片相比，在山楂叶螨为害期内，苹果叶片中的游离脯氨酸含量发生明显变化。为害6 d时，受害叶片内游离脯氨酸含量随螨口密度的增加而上升，显著高于对照的游离脯氨酸含量。但为害8、10 d时，脯氨酸含量随螨口密度的增加而降低。

山楂叶螨螨口密度较低时（10 头/叶），叶片中游离脯氨酸含量随为害时间延长持续升高，为害10 d的含量最高，是对照叶片含量的1.79倍。随着螨口密度的增加，游离脯氨酸含量随为害时间延长下降，为害8、10 d时，30 头/叶含量低于对照叶片。

3讨论与结论

叶螨为害可对植物产生诸多影响，如叶绿素含量[15，16]，糖类和矿物质元素含量[15，17，18]，蛋白质、氨基酸含量[9，17]，抗氧化酶活性[9，19]，蛋白酶抑制剂活性[20，21]，光合作用、蒸腾作用[15，22，23]等变化明显，同时，叶片细胞超微结构也会发生显著变化[3，8]。叶绿体是植物完成光合作用的场所，其结构完整是保证光合作用正常进行的前提，而其对逆境胁迫比较敏感[24，25]。本研究结果表明，富士苹果叶片叶肉细胞对3种害螨胁迫反应敏感的细胞器均为叶绿体，受害后的叶绿体形状发生改变，排列趋于混乱，内部结构被损坏。相关研究发现，叶绿体是植物细胞中产生活性氧的重要场所之一[26]。在害螨胁迫下，植物会产生过多活性氧，造成细胞水平的氧伤害，叶绿体、线粒体等细胞器功能损害，DNA等其他生物大分子降解和失活，最终诱发细胞过敏性坏死[19，27]。

植物细胞内的淀粉粒由光合作用产生，其运输一般以蔗糖-Pi形式进行[28]。随着害螨对叶肉细胞膜系统的破坏，光合作用产物输送受阻，导致在叶绿体中积累大量淀粉粒。本研究在对山楂叶螨为害的富士苹果叶片细胞进行超微结构观察时，发现针状结晶沉淀物，该类物质可能在抵抗山楂叶螨刺吸胁迫中具有重要作用，是富士苹果对山楂叶螨为害防卫机制的一种表现形式。

游离脯氨酸作为植物体内重要的渗透调节物质之一，其含量高低与植物抗逆能力有关[29]。叶片中的游离脯氨酸含量与其相对含水量呈明显负相关[30]，其含量的增加是引起渗透势下降的一个关键因素，有助于细胞或组织保持水分，维持蛋白质、膜和亚细胞结构的稳定。汤章城[31]和Hare等[32]研究显示，逆境下植物体内游离脯氨酸含量往往会升高。山楂叶螨为害初期，苹果叶片细胞没有受到严重破坏，会通过产生游离脯氨酸对抗叶螨，故叶片内的游离脯氨酸含量上升，这也说明苹果叶片能够通过游离脯氨酸的累积避免细胞受到渗透胁迫的伤害。随着山楂叶螨数量增加和为害程度加重，当超过苹果叶片所承受的范围时，苹果叶片渗透调节机制失效，游离脯氨酸含量下降，甚至低于对照。

本研究只做了3种苹果害螨在10 头/叶下为害6 d对富士苹果叶片细胞超微结构的影响，不同为害时间及不同苹果品种在不同叶螨为害下的细胞超微结构变化情况仍待进一步研究。前人研究发现脯氨酸能够参与植物叶绿素合成[31]，其含量的变化是否有利于苹果叶片通过光合作用对螨害进行营养补偿值得进一步研究。

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