粘液形成菌致垢基因调控网络的建模及算法研究

刘然

【摘 要】微生物污垢形成是极其复杂的动量、能量和质量传递过程，是多影响因素共同作用的结果，具有普遍性、非线性、强时变性和强匹配性等特点。本文以粘液形成菌为菌种，研究高频电场对微生物污垢的影响，并通过高频电场对比试验进行蛋白质组学实验，找出致垢蛋白和致垢基因，并通过基因测序基因对致垢基因进行准确定位，最后建立起致垢微生物基因的调控网络模型，同时分析贝叶斯网络模型。

【关键词】基因调控网络 粘液形成菌 贝叶斯网络模型

1 引言

粘液形成菌是水中悬浮的粘泥的异养菌，这类细菌具有粘附力，同时分泌出粘液状物质，能形成胞外高聚物（EPS）。EPS具有粘性，使得细菌容易附着在各种颗粒物质表面，如粘土、石膏、腐殖质和碎片等。由于这一类细菌都是好氧细菌，当其在金属表面进行生命活动时，就会在金属表面形成阳极区和阴极区，从而构成氧浓差或其它浓度差电池，对金属的局部造成腐蚀。此外，此类细菌是好氧型，能把生物膜中的氧离子消耗，使其空间为无氧环境，为厌氧性细菌的生存创造条件，进而导致混合型细菌的腐蚀。而且这类细菌能促使水质恶化、增加水体粘度、破坏油层和腐蚀设备等多重副效应[1]。

2 基因组测序实验

2.1测序流程

文库构建 →→ 桥式PCR →→ Illumina MiSeq测序

2.2 流程说明

2.2.1文库构建：

收集纯化基因组DNA[2]；利用Covaris进行基因组DNA片段化，构建基因组测序文库；连接A & B接头；筛选去除接头自连片段；琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，保留一端是A接头、一端是B接头的片段；氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.2.2桥式PCR

DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成桥；PCR扩增，产生DNA簇。

2.2.3 Illumina MiSeq测序

加入改造过的DNA聚合酶，每次循环只掺入单种碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

3 蛋白质组测序实验

3.1致垢蛋白质实验

实验流程：

水化上样（ 被动上样）：从冰箱里拿出IPG胶条，常温下保持10min以上。在水化盘槽的边上从左向右直线添加样品，靠近水化盘槽两个端边各约1cm 不加样，中间加入样品液体必须需要连续。将水化盘中样品溶液上慢慢置于上朝下IPG胶条胶面。放着 45-60min 胶条吸收将绝大部分样品，沿着胶条轻轻的放上矿物油，放等电聚焦仪在-20℃左右水化12-16小时。

第一向 等电聚焦：将纸电极放在聚焦盘的正负电极上，加上ddH2O5-8μl湿润。将聚焦盘中放入胶面朝下IPG胶条，胶条的负极（标有-）对应在聚焦盘的负极，保证电极和胶条密切接触。均匀覆盖2-3ml矿物油在每根胶条上。使正、负极对好，再盖好盖子。设定等电聚焦程序。结束聚焦的胶条，马上进行平衡、第二向凝胶SDS-PAGE电泳。

第二向SDS-PAGE电泳：配制质量分数13%的丙烯酰胺凝胶。等凝固凝胶后，除去分离胶表面的乙醇、水饱和正丁醇或MilliQ水，用MilliQ水洗洗。组成胶条平衡缓冲液1。将MilliQ水浸湿一张厚滤纸，将过多水分挤去，再直接放在胶条上，慢慢吸尽胶条上的多余样品和矿物油，组成胶条平衡缓冲液2。在首先的结束平衡摇动后，拿出胶条使它立在滤纸上去除过多的液体，放进平衡缓冲液2里，用滤纸吸掉SDS-PAGE胶上部分玻璃间过多的溶液，加热溶解琼脂糖封胶液。在量筒中放入100mlTGS电泳缓冲液。第二次结束平衡后，拿镊子固定住胶条一端让胶面全部沉在1×电泳缓冲液中数次漂洗。将胶条背面面朝玻璃板，慢慢置于长玻板上面，添加低熔点的琼脂糖封胶液。用一定尺寸的胶片，慢慢地向下推胶条，让它和完全接触聚丙烯酰胺凝胶胶面。放上大约5分钟，凝固低熔点琼脂糖封胶液。拧开二向电泳制冷仪，调整温度大约为15℃。电泳结束后，慢慢挪动两层玻璃，拿出凝胶，且划线作为记号之后染色和扫描。

3.2致垢蛋白质分析

选出静态对比试验中的细菌[3]，对它们进行裂解，分离提纯它们的蛋白质，并运用蛋白质组学的相关知识对它们进行2-DE电泳分析，找出差异蛋白质。同时对差异蛋白质进行质谱分析，找出致垢蛋白质序列。尽量分析各种致垢蛋白质对金属腐蚀的协同作用。这些方面牵扯到蛋白质组学的表达水平和蛋白质与蛋白质相互影响，翻译后修饰等等内容，需要的技术是双向凝胶电泳（2-DE）、质谱技术（MS）等。

4 基因调控网络模型

贝叶斯网络模型：贝叶斯网络模型[4]是用隐马尔科夫链和向无环图来表述变量之间的关系。在贝叶斯网络模型下，构建的基因调控网络中，节点表示基因和它的表达水品，边表示基因之间的调控关系，条件概率表用来描述这些调控关系。

以贝叶斯算法为基础，构建调控网络模型，并得到给定参数的条件概率，明确各节点的因果影响关系。贝叶斯网络是用图形的形式来表现变量之间的概率依赖关系，一般包括如下三个步骤：（1）标识影响该领域的变量及其它们的可能值；（2）将变量按某种次序进行排序；（3）给父节点指派局部概率分布。

参考文献：

[1] 杨善让，徐志明，孙灵芳.换热设备污垢与对策（第二版）[M].北京：科学出版社，2004.

[2] Smolen P， Baxter D A， Byrne J H. Modeling transcriptional control in gene networks： Methods，recent result， and future directions. Bulletion of Mathematical Biology， 2000，62：247-292.

[3] R.M坎普.B.威特曼.李博德.蛋白质结构分析：制备、鉴定与微量测序[M].北京：科学出版社，2000

[4] 张宏怡，张军英.基于因果关系挖掘的概率基因调控网络的构建[J].计算机工程，2007，33（15）：26-28.