连续色谱技术在D—核糖纯化中的应用

杜明华

摘 要：采用传统色谱技术和连续色谱技术分别对D-核糖的离交脱盐液和二次结晶母液进行处理，实验结果表明，这两种方法得到的D-核糖纯度和收率均一致，但是连续色谱技术较传统色谱技术的处理量大，得到的产品浓度高，能节省更多的樹脂和用水量，也能节省蒸汽的耗量，是一种符合节能减排政策的生产方法。

关键词：D-核糖；连续色谱技术；节能减排

中图分类号：O658 文献标识码：A

D-核糖是遗传物质核酸和能量物质三磷酸腺苷（ATP）的组成成分，是生物体内的一种天然戊糖，其具有维持心肌能量和缓解肌肉酸痛等生理功能，也能作为前体合成核苷类药物，具有较好的应用前景。

连续色谱技术近年广泛应用于木糖醇与杂糖的分离、果糖与葡萄糖的分离、甘露醇与山梨醇的分离等方面，连续移动床不仅具有设备体积小、占地面积小等优点，而且分离效率高、流动相消耗低，便于自动化连续性生产等优点。

目前D-核糖的生产主要采用发酵提取的方式，整体工艺流程为：D-核糖发酵液除菌、离交树脂脱盐，接着用色谱层析树脂分离得到纯度95%以上的D-核糖，经过两次浓缩结晶后得到产品；二次结晶母液中的D-核糖需要再次色谱分离纯化。生产上采用传统固定床色谱分离技术来实现纯化，但是传统色谱技术存在物料分离不彻底需要返工造成、产品浓度低造成能耗高等等问题，采用连续色谱技术对D-核糖的离交脱盐液（以下简称“正品”）和二次结晶母液（以下简称“母液”）进行分离是一个重大革新。

1 材料与仪器

1.1 进料

物料来自D-核糖专业生产厂家，将正品通过膜浓缩到200g/L，母液用蒸汽浓缩到600g/L备用。

1.2 设备

Sep Tor 20-4连续移动床、Dow糖层析树脂、阿贝折光仪、雷磁DDSJ-318型电导率仪、日本岛津HPLC高压液相色谱。

1.3 D-核糖含量检测

阿贝折光仪初步确定糖含量范围，采用HPLC法进行糖含量的准确检测。

2 实验方法与结果

2.1 传统色谱技术纯化D-核糖

采用装填了2L树脂的柱子在室温下进行D-核糖正品和母液的色谱实验，试管收集流出液，使用电导仪或糖度仪来判断收集的起、止时间，HPLC检测每管的糖浓度和纯度后将所有收集的物料分成三部分：废液、杂糖和产品，计算各部分的总体积、浓度和纯度。对进料体积和洗脱流速优化后，发现单柱的处理周期为5h，单柱色谱实验得到的结果见表1。

从表1可以看出，传统色谱技术能进行D-核糖的纯化，得到了纯度为96%的D-核糖，但是一步单柱色谱实验没法将料液彻底分离，正品仍有50.2%的料需要返工分离，母液有57%的料液需要返工。

通过计算，处理正品的收率为94.7%，处理母液的收率为90.7%；采用传统色谱技术，每升树脂每小时能处理正品中的D-核糖为4g，处理结晶母液中的D-核糖为3.3g。

2.2 连续色谱技术纯化D-核糖

采用20根柱的Sep Tor连续移动床设备来处理正品和母液，柱子中共装填色谱层析树脂16L，在单柱实验的基础上，进行连续移动床流程的设计，处理正品时的流程如图1所示。

流程简介如下：

（1）把连续移动床的20根树脂柱分为4个区，每个区实现不同的功能，其中第一个区1-5#柱为洗脱区，用于洗脱已经分离出来的D-核糖；第二个区6-10#为延长分离区，主要是提高D-核糖纯度、浓度；第三个区11-15#为分离区，主要是分离出杂糖和盐；第四个区16-20#为浓缩回流区，提高杂糖浓度，第四区的出水，可以回用到1区作为进水。

（2）待分离的物料从第三个区进入系统，液流方向从左到右推动结合力弱的杂糖组分迁移，而树脂柱则由右向左逆向移动，把结合力强的组分D-核糖夹带逆向移动，从而实现分离。

（3）经过第二区和第三区的分离，基本实现D-核糖和杂糖的分离，杂糖从第三区流出；而D-核糖则在树脂柱的逆向运动作用下带到第一个区。

（4）D-核糖到达第一个区后，在洗脱水的推动力作用下流出。

（5）杂糖进入第四区后，经过反复上下柱，实现杂糖组分的浓缩，出水可返回到一区循环利用。

由于母液中的D-核糖纯度比正品低，在处理母液时，会将延伸分离区增加到6根柱子，而减少分离区1根柱。

为了得到最佳的实验效果，首先对转盘周期和处理量进行优化，待系统运行稳定后检测产品的纯度和收率，确定连续色谱技术的初步运行条件，接着进行产品浓度和回用水量的优化实验。优化实验结束后连续运行10～15天，考察处理量、产品的浓度、纯度、收率以及水耗量等各项指标；整个实验过程均在室温下进行。实验结果见表2。

实验结果汇总后，以天为单位计算各组分的纯度和收率，得到的平均结果见表2，最终优化的实验周期为260min/圈。

从表2可以看出，连续色谱技术能一步实现D-核糖的分离纯化；从产品纯度上看，处理正品得到的D-核糖纯度能达到97%，收率能达到95.6%；而处理母液得到的D-核糖纯度也可以达到96%，但是收率只有91.3%。

计算树脂的处理量，采用连续色谱技术，每升树脂每小时能处理正品中的D-核糖为6g，处理结晶母液中的D-核糖为5.2g。

2.3 两种技术比较

根据以上固定床与连续移动床的实验结果来考察两者的消耗差别，以年产1000t D-核糖为例，每天大约需要处理18.3m?浓度为200g/L的D-核糖正品和1.1m?浓度为600g/L的母液，每天得到的各组分体积、浓度以及需要的水量和树脂用量见表3。

从表3可以明显看出连续移动床色谱技术比固定床色谱技术有以下优势：

（1）不会产生套用液，不用返工处理；

（2）得到的产品浓度高；

（3）用水量省；

（4）树脂用量省；

（5）单位树脂处理物料快。具体节省量见表4。

表4连续色谱技术相对传统色谱技术的节省量

项目 固定床 移动床 节约量

M?/D M?/D %

废水排放量 90.2 72.2 20.0

水耗 198.4 89.2 55.0

樹脂 46.5 30.5 34.4

节约蒸汽 64.5t/D

两种色谱技术产生的产品浓度不一样需要蒸发到一致，表4按照1吨蒸汽蒸发三吨水来计算需要的蒸汽量，从表中可以看出，年产1000tD-核糖，连续色谱技术的树脂用量要比传统色谱技术节省34.4%，水耗要节省55%，废水排放量要省20%，由于固定床有套用液且产品浓度比移动床的低，为此每天要多消耗64.5t蒸汽进行浓缩。

结论

连续色谱技术能用于不同纯度D-核糖物料的分离纯化，说明连续色谱技术具有较好的适用范围。

采用传统色谱技术和连续移动床色谱技术均能从正品或母液中得到纯度为95%以上的D-核糖，处理正品时的收率均在95%左右，处理母液时的收率均在91%左右。

但连续色谱技术中单位树脂处理D-核糖的速度比传统色谱技术要快：前者处理正品中D-核糖的速度为6g/L·H，处理结晶母液时的速度为5.2g/L·H；而固定床色谱技术处理正品时的速度只有4g/L·H，处理结晶母液时的速度只有 3.3g/L·H。

产品浓度方面，连续色谱技术处理正品时得到的产品浓度为102g/L，处理母液时的产品浓度为84g/L；传统色谱技术处理正品时得到的产品浓度只有29g/L，处理母液时的产品浓度为64g/L。

根据实验结果，当年处理1000t D-核糖时，连续移动床的树脂用量要比固定床节省34.4%，每天用水量要省55%，废水排放量要少20%，由于固定床有套用液和产品浓度比移动床的低，为此每天要多消耗64.5t蒸汽进行浓缩。

综上所述，采用连续色谱技术实现正品和二次结晶母液中D-核糖的纯化是完全可行的，结果中各指标均优于传统的色谱技术，是一种符合国家节能减排政策的生产方法。

参考文献

[1]文平怀，符健，黄川，等.D-核糖对实验性心肌缺血和心律失常的作用研究[J].中国药业药物研究，2005（10）：26-28.

[2]杨新超，刘建军，赵祥颖.D-核糖的性质、生产及应用[J].中山大学学报（自然科学版），2005（A1）：197-202.

[3]张丽莉，张少倩，李磊，等.移动床亲合色谱在分离果葡糖浆工业生产中的应用[J].广东化工，2008（02）：55-57.

[4]周珏，魏转，孙文敬，等.D-核糖的生产及应用[J].食品科技，2014（10）：273-278

[5]张津枫，王建刚，邓国才，等.葡萄糖发酵液D-核糖含量的高效液相色谱分析[J].高等学校化学学报，2001（01）：43-45.