白及种子萌发及原球茎发育过程的细胞组织学观察

2016-05-14聂宁朱艳田梅华静雯王龙秦民坚

中国中药杂志 2016年8期

聂宁朱艳田梅华静雯王龙秦民坚

[摘要]为探讨白及种子发育成苗的机制，对组织培养条件下种子萌发过程和原球茎发育过程进行了形态学和石蜡切片细胞组织学观察。结果表明：白及种子吸水膨胀后，出现极性，远离胚柄端分化出绿色芽点，芽点发育成子叶，同时种胚突破种皮形成原球茎，另一端则出现成群的白色绒毛状假根。原球茎顶端分生组织的发育遵循原套原体学说，内部分化出多束维管束后，白及由原球茎过渡到根状茎阶段。其中根原基的发育始于根状茎维管束，为内起源。当根状茎逐渐膨大，内部基本分生组织分化为成熟薄壁组织后，假鳞茎开始形成。白及种子的发育共经过种胚、原球茎、根状茎和假鳞茎4个阶段。

[关键词]白及；原球茎；细胞组织学

[Abstract]In order to investigate the mechanism of growth for Bletilla striata， which could be applied for rapid propagation， morphological and cytohistological of seed germination and protocorm development in vitro culture were observed using paraffin section techniques In this study， we have found that the development of B striata goes through four stages： embryo， protocorm， rhizome and pseudobulb The end away from embryo suspensor is able to differentiate green buds after the seed of B striata swelling， growing point At the same time， the other end of embryo grows many white villous roots， with the green bud differentiating into cotyledon， the embryo breaking through seed coat and being protocorm The shoot apical meristem of protocorm consists of tunica， corpus and leaf primordium， whose developmental flowing tunicacorpus theory After more vascular bundle appeared from the leaf primordium， B striata grows into the stage of rhizome While in the stage of rhizome， the root primordium of tissue culture seedlings are differentia initially that derived from rhizome vascular bundle， belonging to internal origin Subsequently， the pseudobulb forms by the inner meristem growing into mature parenchymatous tissue and the rhizome enlargement gradually

[Key words]Bletilla striata； protocorm； cytohistological

doi：10.4268/cjcmm20160813

白及Bletilla striata（ Thunb ） Reichb f 为兰科白及属药用植物，以干燥块茎入药，具有收敛止血、消肿生肌的功效，主治咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂[1]等症，是我国民间常用中药[23]。白及不仅具有较高的药用价值，同时在化妆品行业[45]和园艺业前景也很广阔，具有较高的市场经济价值。白及自然繁殖系数低，生态环境破坏以及过度采挖和资源不合理利用，造成了白及资源供需之间的紧张状况。传统繁殖方法多采用挖掘野生资源进行分株繁殖，但这种繁殖方式周期长，效率低[6]，难以满足市场需求。植物组织培养作为白及的一种繁殖方式[7]，解决了白及种子无法正常萌发而导致繁殖周期较长、繁殖率低的难题。近年来有关白及组织培养快速繁殖报道较多[8]，但有关白及种子及原球茎发育的解剖学研究尚未见报道。本研究以组织培养为基础，观察白及种子不同发育时期的内部结构变化，以期为白及快速繁殖机制研究奠定细胞组织学基础。

1材料

白及果实采于南京中山植物园，经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定为兰科植物白及的成熟蒴果。凭证标本存放于中国药科大学中药资源教研室。

2方法

21种子萌发

取白及成熟未开裂蒴果，自来水下洗去泥沙灰尘，经洗衣粉水浸泡20 min，自来水反复冲洗，RO水润洗干净后置于超净台。消毒步骤：75%乙醇浸泡1 min，无菌水润洗2次，NaClO溶液（有效氯≥5%）浸泡10 min，无菌水反复润洗5次，随后用无菌滤纸拭干表面水分，解剖刀纵向切开，将种子均匀撒播在备好的萌发培养基上。

萌发培养基为1/2MS+NAA 05 mg·L-1，培养条件：（26±2） ℃；光照度1 500～2 000 lx；光照时长11 h·d-1。自播种之日起每隔2 d取样1次，光学显微镜下观察种子萌发形态变化，同时样品用FAA固定液固定，备用。

22原球茎发育

待种子萌发至原球茎阶段后，即进行继代培养，将原球茎按3～5个为1丛，每瓶接种8～10丛，培养约60 d后，转入壮苗培养基培养。

培养基为MS培养基（继代培养），MS+NAA 02 mg·L-1+6BA 20 mg·L-1+土豆汁75 g·L-1（壮苗培养）。培养条件为（26±2） ℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时长11 h·d-1。待原球茎培养15，30，60 d，以及长成带叶小苗分别取样，FAA固定液固定，备用。

23种子萌发和原球茎发育过程中的形态解剖学观察

观察不同时期种子萌发和原球茎发育结构变化，并以其为材料进行常规石蜡切片法制片，切片机（820 Histo STAT Reichert）切片，切片厚度8 μm，海氏苏木精染色，光学显微镜（Nikon Eclipse E200）下观察。

3结果与分析

31形态学观察

311种子萌发形态学观察白及种子细小，构造简单，显微镜下观察种胚呈纺锤形，由1层透明的种皮包裹，播种时种胚呈棕黄色，一端具残留的胚柄（图1，A）。2 d后种子吸水膨胀开始变绿，远离胚柄的一端渐渐呈凸起状（图1，B），此时白及种子由异养向自养转换[9]。继续培养，6 d后种胚发育生长开始撑破一端的种皮，进入原球茎阶段（图1，C）。培养基上观察可发现，与种胚凸起相对的一端出现白色绒毛状“假根”[10]，猜测为种子吸收营养成分的结构。培养10 d后种子迅速萌发，完全突破种皮，顶端已经有了叶原基的分化（图1，D），接着4 d后，种子分化出子叶（图1，E），形成小苗。培养20 d，白及开始长出幼叶（图1，F）。该萌发动态过程与王楷[11]、张燕[12]等研究一致。

312原球茎发育形态学观察当原球茎转入继代培养基15 d后，植株基部长出大量毛状根，有的已经形成明显的不定根，同一瓶中生长状态并不统一，发育较快的小苗甚至已分化出第3片小叶。继续培养，组培苗不断生长，叶片舒展，植株增高，基部由最初的球形原球茎转变为长条状的根状茎结构，此时根部正在大量吸收养分以满足植株迅速发育。待小苗长至1～15 cm 时转入壮苗培养基中，小苗茎、叶的长势渐缓，但根状茎明显变粗，呈球形，进入假鳞茎阶段；在激素的作用下，假鳞茎基部分化出不定根，更有利于吸收营养。

32细胞组织学观察

321种子萌发的细胞组织学观察白及种胚表面为1层体积小，排列紧密的细胞，中间细胞体积

较大，内含物较多（图2，A），培养2 d后，一端出现极性，开始分化出较多体积小，质浓，核大的细胞，随着培养时间变长，这部分的细胞不断增殖分化逐渐凸起，向种皮合点端突破，形成原球茎。原球茎顶端的原分生组织进一步分化出叶原基，形成子叶（图2，B）。原球茎继续发育，顶端分生组织在不断分化出叶原基的同时，向内逐渐分化出一束维管束，表皮始终为一层细胞：排列紧密，细胞体积小，细胞核大，居于中央。显微下观察发现维管束周围围绕着一团分生组织细胞，不断分化出维管组织细胞（图2，C），使得维管束不断向基部延伸，最终起到连接根和叶的作用。

322原球茎发育细胞组织学观察原球茎培养30 d的纵切面最大剖面顶端分生组织结构图（图2，D），原球茎顶端分生组织的发育遵循原套原体学说[1314]。图2中所示A，B分别为原套和原体，在其以下部位为叶原基。茎顶端的分生区细胞向外分化成幼叶的同时，向内形成维管束。当维管束由一束分化成多束时，白及由原球茎阶段进入根状茎阶段。随着幼叶的发育，基部的分生组织分化为居间分生组织，其结果是使叶片不断伸长变宽；维管束周围包裹着一团细胞核较大、体积较小、排列紧密的分裂细胞，共同构成原形成层。原形成层细胞代谢活动旺盛，分裂能力强，同时也在不断分化出维管束细胞和薄壁细胞（图2，E），向与顶端分生组织相对的基部延伸。根状茎阶段，内部组织出现大量核大，液泡小的细胞，越靠近顶端分生区的细胞体积越小，排列越紧密，为基本分生组织细胞，来源于初生分生组织结构，其分裂衍生的细胞可促进根状茎扩大。继续培养，根状茎基部开始分化出不定根，白及的不定根起源于由顶端延伸至基部的维管束鞘结构，属于内

LP叶原基； EP表皮； SAM 顶端分生组织； VB 维管束； RhVB 根状茎维管束； RVB 根维管束； Sc 厚壁组织； En内皮层； Pe 中柱鞘； PX初生木质部； PP 初生韧皮部；A种胚纵剖面显微图； B 种子萌发10 d纵剖面显微图； C 种子萌发16 d纵剖面显微图； D 培养30 d 原球茎纵剖面显微图； E 具维管束的根状茎纵剖面显微图； F 根维管束开始出现； G 成熟不定根横切面显微图； H 根状茎纵剖面显微图； I 假鳞茎开始形成； J 假鳞茎纵剖面显微图。

图2白及种子萌发及原球茎发育显微解剖

Fig2Microscopic anatomy of seed germination and protocorm development

起源[15]。维管束鞘中的一部分细胞经脱分化，恢复分裂能力，细胞质变浓、核变大、液泡缩小，形成根原基细胞。根原基不断分化、伸长，从而形成不定根（图2，F）。在继代培养基中，白及发育迅速，根状茎顶端不断分化出幼叶，每一片幼叶基部向外分裂增生，使叶片伸长，向内分裂分化成维管组织，最终与基部的不定根连接。随着不定根的生长，最早形成的子叶逐渐脱落，与其相连的薄壁组织也渐渐退化（图2，H）。将小苗转入壮苗培养基后，根状茎基部渐渐膨大，基本分生组织分化为液泡较大的薄壁组织，开始积累养分，假鳞茎初始形成。在激素的作用下，假鳞茎叶腋处开始分化出多个芽原基（图2，I），为不定芽的起点，不定芽不断发育生长，最终形成完整小苗，基部生成不定根，与母体剥离。而此时母体发育的速度渐渐放缓，假鳞茎逐渐增粗，内部形成大量的薄壁细胞（图2，J），根部组织也已发育成熟（图2，G）。

4讨论

白及由种子发育为完整植株大致经过4个阶段：种胚、原球茎、根状茎、假鳞茎。

41种胚原球茎的转化

白及种子不含胚乳，在解剖镜下分离开种皮后，为1个椭球形的种胚，纵切面和横切面观察发现无胚根、胚轴和胚芽的分化，仅由1层排列紧密的表皮细胞包裹着内含物较多的薄壁细胞。白及幼叶起源于种胚具有极性一端的分生组织的外部细胞，属于外起源[14]，白及种子萌发时不形成胚根，而是先膨胀变绿[12]，待种胚发育为原球茎后，其基部通过表皮细胞的凸起产生大量白色绒毛状“假根”，来吸收培养基上的水分和营养物质。所谓原球茎是兰科种子萌发过程中的一种形态学构造，种子萌发初期，经吸水膨胀，突破种皮形成的球形或椭球形的结构[16]，白及种子萌发大约8～10 d即可形成原球茎。原球茎代谢活动旺盛，遗传性状稳定[16]，利用原球茎进行继代培养可迅速获得增殖小苗，是白及快繁技术的关键。

42原球茎根状茎假鳞茎的转化

白及发育过程大致遵循兰科基本发育规律。原球茎分化出多束维管束，进入根状茎阶段。根状茎维管束为外韧型维管束，无束中形成层，其生长发育过程中，维管束数目不断增多，为典型的单子叶植物初生构造。随着维管束组织的成熟，根状茎不再伸长，而慢慢膨大，基本分生组织分化为成熟的薄壁组织，为贮存养分主要器官[10]。在白及由原球茎发育为假鳞茎的过程中，养分的积累量也发生着变化，其中原球茎和假鳞茎由于细胞不断分裂分化，薄壁细胞中贮存了大量的养分，而根状茎则因为不断的发育生长，薄壁组织不成熟而养分较少[17]。

实验观察发现，组织培养条件下不定芽的分化与室外栽培条件下的分化略有不同，白及种子经过组织培养，大致4～5个月即可形成球形假鳞茎，通过外加激素的作用，假鳞茎可分化出多个不定芽，而此时母体也在不断生长。这些不定芽在发育成完整小苗时，基部会分化出不定根，从而与母体形成彻底的生理隔离。而在室外栽培条件下，成熟白及只有在当年地上部分枯萎后，其地下假鳞茎才会萌发出不定芽，且此时假鳞茎具有明显分叉。

43有关白及种子发育途径的讨论

作者在进行种胚发育进程实验时，发现种子在不含激素和含激素NAA（05～10 mg·L-1）培养基上，种子萌发成苗的形态有较大的不同。当仅在1/2MS培养基上生长时，小苗（子叶分化完全）基部膨大的球体呈绿色；而当培养基中添加NAA（05～10 mg·L-1）时，膨大小球体为白色透明状，该小球体在发育过程中也会不断产生白色绒毛状“假根”。张燕[18]、崔瑞勤[19]等研究认为白及萌发可经过原球茎和根状茎2个途径发育成苗，不同的培养基上发育途径可能不一致。细胞组织学观察发现，根状茎的形成建立于内部维管束组织的分化[1617]，但胚性细胞团是否可直接分化形成维管束还有待进一步的研究。

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