Dickkopf—1在肺癌相关恶性胸腔积液中的表达和临床意义

曾庆哲 张浩清 杨瑞青

[摘要] 目的 分析Dickkopf-1（DKK-1）在良恶性胸腔积液中的表达，探讨其在鉴别胸水良恶性和判断预后中的价值。 方法 分别用酶联免疫吸附测定（ELISA）法和放射免疫法检测2010年4月～2012年9月阜阳市第一人民医院收治的56例肺癌相关恶性胸腔积液和41例良性胸腔积液患者胸水中DKK-1和癌胚抗原（CEA）水平。 结果 肺癌相关恶性胸腔积液DKK-1水平为（43.9±19.4）ng/mL，显著高于良性胸腔积液的（18.5±8.6）ng/mL（P < 0.01）；肺癌相关恶性胸腔积液的CEA水平为8.57（5.22，13.08）ng/mL，亦高于良性胸腔积液的3.46（2.49，5.10）ng/mL（P < 0.01）；异常升高的DKK-1与肿瘤分期有关，而CEA升高与肿瘤病理性质有关；ROC曲线分析显示DKK-1升高最佳临界值为36.3 ng/mL，对于诊断恶性胸腔积液的灵敏度和特异度分别为68.7%和73.5%；而CEA的灵敏度和特异度依次为60.4%和77.2%，CEA与DKK-1联合运用时，灵敏度和特异度可提高至77.2%和80.4%。在肺癌相关恶性胸腔积液患者中，DKK-1<43.9 ng/mL患者3年总生存率为42.85%，高于DKK-1≥43.9 ng/mL的患者（21.42%）（P < 0.05）。 结论 Dickkopf-1在肺癌相关恶性胸腔积液中明显升高，了解Dickkopf-1水平有助于鉴别胸水性质并协助判断总体预后，有一定的临床应用价值。

[关键词] 胸腔积液；DKK-1；癌胚抗原；鉴别

[中图分类号] R561 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（b）-0108-04

[Abstract] Objective To analyze the expression of Dickkopf-1 （DKK-1） in benign and malignant pleural effusion， and to investigate the value of it in identifying benign and malignant pleural effusion and judging the overall prognosis. Methods Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） and radio-immunity method was conducted to detect the value of DKK-1 and carcino-embryonic antigen （CEA） in 56 cases of patients with malignant pleural effusion associated with lung cancer and 41 cases with benign pleural effusions admitted to the First People's Hospital of Fuyang City from April 2010 to September 2012. Results The content of DKK-1 in malignant pleural effusion was （43.9±19.4） ng/mL， which was significantly higher than that of benign pleural effusion [（18.5±8.6） ng/mL] （P < 0.01）； in addition， the value of CEA in malignant pleural effusion was 8.57 （5.22， 13.08） ng/mL， which was also significantly higher than that of benign pleural effusion [3.46 （2.49， 5.10） ng/mL] （P < 0.01）. The abnormally raised DKK-1 was associated with tumor stage， while CEA was associated with tumor pathological nature. ROC curve analysis showed that the best threshold of DKK-1 was 36.3 ng/mL， the sensitivity and specificity were 68.7% and 73.5% respectively in diagnosis of malignant pleural effusion. What's more， the sensitivity and specificity of CEA were 60.4% and 77.2%， while it could be elevated to 77.2% and 80.4% when DKK-1 and CEA were used together. In the patients with malignant pleural effusion associated with lung cancer， the 3 years overall survival rate in DKK-1<43.9 ng/mL patients was 42.85%， which was significantly higher than that of DKK-1≥43.9 ng/mL patients （21.42%） （P < 0.05）. Conclusion The value of Dickkopf-1 is obviously raised in malignant pleural effusion associated with lung cancer， knowing about Dickkopf-1 is helpful to identify the properties of pleural fluid and judge the overall prognosis， which has a certain application value in clinical practice.

[Key words] Pleural effusion； Dickkopf-1； Carcino-embryonic antigen； Identification

Dickkopf（DKK）家族是Wnt-β-catenin信号转导通路中的重要调节因子，它们通过调控Wnt通路的下游基因活性而发挥促进或抑制肿瘤发生、发展的作用。Dickkopf-1（DKK-1）是DKK家族中的一员[1]，研究证实，DKK-1通过结合低密度脂蛋白受体相关蛋白6，产生抑制Wnt下游信号传导通路效应，发挥抑制肿瘤增殖分化作用[2]。DKK-1已经证实在肺癌、大肠癌、胃癌、子宫内膜癌等多种肿瘤组织以及血清样本中表达异常[3-5]，但是关于恶性胸水中的含量以及临床意义的研究仍然十分少见。本研究旨在分析良恶性胸水中DKK-1的表达以及临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年4月～2012年9月阜阳市第一人民医院收治的胸腔积液患者97例，男58例，女39例，年龄22～75岁，平均（52.8±10.1）岁。所有患者均明确诊断为恶性或良性胸腔积液，符合2014年版《恶性胸腔积液诊断与治疗专家共识》[6]意见中的诊断标准。其中恶性胸腔积液患者56例，男31例，女25例；年龄34～75岁，平均（54.9±9.7）岁；病因均为肺癌；TNM分期Ⅰ期2例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期19例；有淋巴结转移者32例，无淋巴结转移者24例。良性胸腔积液41例，男27例，女14例，年龄（49.9±10.3）岁。

1.2 样本采集及检测

所有患者入院后行胸腔穿刺，留取胸水10 mL，离心半径6 cm，3000 r/min离心15 min后留取上清液4 mL，分装2管，置于-20℃冰箱保存待检。DKK-1含量由ELISA法测得，试剂购于美国R&D公司，按照吸光度计算标准曲线。癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）由Beckman全自动生化分析仪行放射免疫法检测。CEA>5 ng/mL为异常升高，DKK-1界值由受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）的方法获得。

1.3 随访

对56例肺癌相关胸腔积液患者进行定期随访，每月至少1次，了解患者生存情况，记录生存时间。随访起点为确诊当日，随访期限3年，死亡患者自动终止随访。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）[M（QL，QU）]表示，采取Wilconxon秩和检验。计数资料采用χ2检验。DKK-1和CEA在鉴别良恶性胸水中的价值由ROC曲线评估，生存分析采用Kaplan-Meier方法，生存时间差异采用Log-rank检验。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同性质胸水中DKK-1和CEA含量比较

肺癌相关恶性胸腔积液中DKK-1和CEA水平明显高于良性胸水，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 DKK-1和CEA鉴别良恶性胸水的价值

ROC曲线结果显示，DKK-1诊断肺癌相关恶性胸腔积液的曲线下面积（area under cuver，AUC）为0.706（0.600，0.813），对应最佳灵敏度和特异度依次为68.7%和73.5%，此时DKK-1升高的最佳临界值为36.3 ng/mL。

曲线中，CEA的AUC为0.625（0.541，0.736），与DKK-1比较差异无统计学意义（P > 0.05）；CEA鉴别良恶性胸水的最优灵敏度和特异度为60.4%和77.2%。结果显示，DKK-1诊断肺癌相关恶性胸腔积液的灵敏度占优，但特异性不及传统肿瘤标志物CEA。当两者联合检测时，灵敏度和特异度可提高至77.2%和80.4%。见图1。

2.3 DKK-1和CEA含量与肿瘤临床病理的相关性

DKK-1升高与肿瘤分期有关，Ⅲ、Ⅳ期患者DKK-1水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P < 0.05）。而CEA升高与肿瘤病理性质有关，CEA升高患者中腺癌比重最高（P < 0.05）。见表2。

2.4 DKK-1判断肺癌相关恶性胸腔积液患者预后的价值

随访期间，共2例患者失访，其余54例患者均完成随访，失访率为3.57%。根据表1结果，54例肺癌相关恶性胸腔积液患者胸水中DKK-1平均水平为43.9 ng/mL，以平均水平为分界线，将54例患者分为DKK-1<43.9 ng/mL组和DKK-1≥43.9 ng/mL组，每组27例。DKK-1<43.9 ng/mL组中位生存时间为28个月（95%CI：26.2～29.7个月），长于DKK-1≥43.9 ng/mL组中位生存时间为20个月（95%CI：18.6～21.3个月），差异有统计学意义（P < 0.05）。DKK-1<43.9 ng/mL组3年总生存率为42.85%，亦高于DKK-1≥43.9 ng/mL的21.42%（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

Wnt-β-catenin信号转导通路是肿瘤基因表达异常的重要通路，大量调节细胞分化成熟、增殖、突变的基因通过该通路参与肿瘤的发生发展[7]。研究提示，大多数肿瘤患者Wnt-β-catenin信号通路异常激活，细胞分化异常，增殖速度加快，表现为无休止的“歪曲生长”，而这些特征在Wnt通路失活后可以得到显著抑制[8-9]。Wnt信号通路有一系列调节因子，调控信号传导的活化与抑制，DKK家族中的DKK-1既是其中之一。

现已明确，DKK-1是β-catenin下游靶基因，通过结合低密度脂蛋白受体相关蛋白6，产生抑制Wnt下游信号传导通路效应，发挥抑制肿瘤增殖分化作用[10]。研究发现，DKK-1在肝癌[11]、肺癌[12-13]、结肠癌[14]、鼻咽癌[15]等多种肿瘤中表达异常，且有学者认为，大肠癌细胞核DKK-1基因表达上调，DKK-1升高的患者对化疗药物敏感性差，总体生存率、无瘤生存率不佳，了解DKK-1水平有助于判断预后[16]。徐吟亚[17]指出，肺癌患者血清DKK-1明显升高，DKK-1可以用于肺癌诊断和了解有无骨骼转移。除此之外，DKK-1还和肿瘤细胞的生长、侵袭活性有关[18-22]，DKK-1还能抑制肿瘤血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）[23]。由此可见，测定组织、血清、体液中DKK-1的表达量对于了解肿瘤患者生理状态意义显著。但是，当前国内外对于胸水中DKK-1水平以及鉴定胸水性质的研究仍十分少见。

本研究中，56例肺癌相关恶性胸腔积液中的DKK-1水平为（43.9±19.4）ng/mL，明显高于良性疾病所致的胸腔积液（P < 0.05）。异常升高的DKK-1与肿瘤分期有关，Ⅲ～Ⅳ期患者DKK-1水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P < 0.05），笔者推测，这可能与进展期肿瘤细胞侵袭范围更广、胸水中脱落细胞增多以及血清扩散DKK-1量大有关，所以了解DKK-1水平还有助于判断疾病的进展阶段。

为了探讨DKK-1在鉴别良恶性胸水中的价值，笔者引入ROC曲线的方法进行分析。本组研究中，DKK-1和传统肿瘤标志物CEA的AUC均超过0.7，且无明显差异（P > 0.05），提示两项指标均具有可靠的诊断价值。进一步分析敏感性和特异性，结果显示，DKK-1诊断恶性胸腔积液的敏感性为68.7%，优于CEA的敏感性60.4%，但是，特异性不及传统肿瘤标志物CEA（73.5%比77.2%）。当两者联合运用时，敏感性和特异性可提高至77.2%和80.4%，较两者单独运用时明显升高。所以，在临床上为了更加准确地鉴别恶性胸水，笔者建议将DKK-1和CEA联合检测，弥补双方的缺陷。

本研究还对56例肺癌相关性恶性胸腔积液的患者进行随访，统计总体生存时间和生存率差异，结果发现，DKK-1<43.9 ng/mL组中位生存时间和3年总体生存率优于DKK-1≥43.9 ng/mL组患者。如前所述，DKK-1水平与肺癌患者临床分期有关，因此推测，造成DKK-1<43.9 ng/mL组患者预后相对较好的原因与患者疾病分期较早有关，而DKK-1≥43.9 ng/mL的肺癌患者多数进入中晚期，总体预后不良。所以，当肺癌相关性恶性胸腔积液患者DKK-1水平明显升高时，对提示总体预后也有一定指导意义，为制订治疗方案提供一定参考。

综上所述，Dickkopf-1在恶性胸腔积液中明显升高，了解Dickkopf-1水平有助于鉴别胸水性质并协助判断总体预后，可能成为一种新的标志物。

[参考文献]

[1] Lin CH，Ji T，Chen CF，et al. Wnt signaling in osteosarcoma [J]. Adv Exp Med Biol，2014，804（804）：33-45.

[2] Niehrs C. Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators [J]. Oncogene，2006，25（57）：7469-7481.

[3] Li Y，Ma C，Shi X，et al. Effect of nitric oxide synthase on multiple drug resistance is related to Wnt signaling in non-small celllung cancer [J]. Oncol Rep，2014，32（4）：1703-1708.

[4] 胡海青，阮洪军.胃癌患者血清Dickkopf-1的表达及其临床意义[J].肿瘤学杂志，2012，18（10）：750-753.

[5] Jiang T，Wang S，Huang L，et al. Clinical significance of serum DKK-1 in patients with gynecological cancer [J]. Int J Gynecol Cancer，2009，19（7）：1177-1181.

[6] 中国恶性胸腔积液诊断与治疗专家共识组.恶性胸腔积液诊断与治疗专家共识[J].中华内科杂志，2014，53（3）：251-255.

[7] 刘厚琴，王毅.WNT信号通路研究进展[J].社区医学杂志，2015，13（5）：15-18.

[8] Fan K，Li N，Qi J，et al. Wnt/β-catenin signaling induces the transcription of cystathionine-γ-lyase，a stimulator of tumor in colon cancer [J]. Cell Signal，2014，26（12）：2801-2808.

[9] 张静，霍满鹏，慕明涛.β-catenin与宫颈癌的相关性研究[J].西部医学，2012，24（11）：2136-2137.

[10] 岳文慧，于铁莉，赵瑞力.Dickkopf-1在肿瘤中的作用研究进展[J].山东医药，2014，54（38）：99-101.

[11] Aguilera O，González-Sancho JM，Zaozo S，et al. Nuclear DICKKOPF-1 as a biomarker of chemoresistance and poor clinical outcome in colorectal cancer [J]. Oncotarget，2015，6（8）：5903-5917.

[12] 卢先锋，杨雪琴，张志敏.肺癌血清肿瘤标志物meta分析[J].中国肺癌杂志，2010，13（12）：1136-1140.

[13] 陆鸿略，张淑君，岳文慧，等.DKK-1及Bcl-2蛋白在人鼻腔鼻窦鳞状细胞癌中的表达及意义[J].重庆医学，2015， 44（12）：1652-1657.

[14] Liang L，He H，Lv R，et al. Preliminary mechanism on the methylation modification of Dkk-1 and Dkk-3 in hepatocellular carcinoma [J]. Tumour Biol，2015，36（2）：1245-1250.

[15] Kim HY，Park JH，Won HY，et al. CBX7 inhibits breast tumorigenicity through DKK-1-mediated suppression of the Wnt/β-catenin pathway [J]. FASEB J，2015，29（1）：300-313.

[16] 褚飞虎，曹亚丽，邵建国，等.肝细胞肝癌患者血清糖蛋白Dickkopf-1检测的临床价值研究[J].检验医学与临床，2015，12（23）：3544-3546.

[17] 徐吟亚.血清Dickkopf-1水平在诊断肺癌及其骨转移中的应用价值[J].国际检验医学杂志，2011，32（3）：379-380.

[18] 李银鹏，石芳，杨婧，等.肺癌患者血清和胸水中Dickkopf-1的表达及临床意义[J].河北医药，2015，37（6）：815-818.

[19] 王新颖，王菁，姜泊.Dkk-1在溃疡性结肠炎及大肠癌患者血清中的表达及意义[J].现代消化及介入诊疗，2011， 16（6）：359-361.

[20] 岳文慧，于铁莉，张宇丽，等.喉咽癌组织中Dickkopf-1的表达及意义[J].中国医药导报，2014，11（34）：19-22，封3.

[21] 黄晓红.DKK-1与肿瘤的研究进展[J].成都医学院学报，2014，9（3）：366-369.

[22] 罗俊，郭长城，刘敏，等.膀胱癌患者血清中dickkopf-1的表达[J]上海医学，2013，36（7）：860-863.

[23] 齐丽莎，刘志勇，宋汪昭，等.Dickkopf-1对结肠癌组织血管生成拟态形成的抑制作用及相关机制研究[J].中国肿瘤临床，2015，42（20）：1007-1011.

（收稿日期：2015-12-11 本文编辑：张瑜杰）